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Journal of Environmental Sciences 2020年第4期32卷 59-66页

作者： Lihua Fan Xiaofeng Zhang Ruoxue Zeng Suhua Wang Chenchen Jin Yongqiang He jiangbing shuai Department of Food Science and Nutrition Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food ProcessingZhejiang UniversityHangzhou 310016China Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine Hangzhou 310058China

To correctly assess and properly manage the public health risks associated with exposure to contaminated water,it is necessary to identify the source of fecal pollution in a watershed.In this study,we evaluated the efficacy of our two previously developed real time-quantitative PCR(qPCR)assays for the detection of swine-associated Bacteroidales genetic markers(gene 1-38,gene 3-53)in the Yangtze Delta watershed of southeastern China.The results indicated that the gene 1-38 and 3-53 markers exhibited high accuracy(92.5%,91.7%conditional probability,respectively)in detecting Bacteroidales spp.in water samples.According to binary logistic regression(BLR),these two swine-associated markers were well correlated(P<0.05)with fecal indicators(Escherichia coli and Enterococci spp.)and zoonotic pathogens(E.coli O157:H7,Salmonella spp.and Campylobacter spp.)in water samples.In contrast,concentrations of conventional fecal indicator bacteria(FIB)were not correlated with zoonotic pathogens,suggesting that they are noneffective at detecting fecal pollution events.Collectively,the results obtained in this study demonstrated that a swinetargeted qPCR assay based on two Bacteroidales genes markers(gene 1-38,gene 3-53)could be a useful tool in determining the swine-associated impacts of fecal contamination in a watershed.

关键词： Bacteroidales genes markers Water pollution Real-time quantitative PCR Fecal indicators Zoonotic pathogens

Listeria monocytogenes Mutants Carrying Newcastle Disease Virus F Gene Fused to its actA and plcB:In vitro Expression and Immunogenicity in Chickens

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2007年第1期39卷 57-66页

作者： Lingli JIANG Chunlin KE Jingjing XU Jianshun CHEN Xueyan CHEN Ning CHEN jiangbing shuai and Weihuan FANG Institute of Preventive Veterinary Medicine,and Zhejiang Provincial Key Laboratory for Preventve Veterinary Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China Institute of Preventive Veterinary Medicine and Zhejiang Provincial Key Laboratory for Preventive Veterinary Medicine Zhejiang UniversityHangzhou 310029 China

Recombinant Listeria monocytogenes mutants carrying Newcastle disease virus (NDV) fusionprotein gene F were constructed by homologous recombination.NDV F or its truncated fragment Fa wasused as the model heterologous gene to be integrated into actA or plcB downstream of their signal sequences.Correct orientation of the inserted genes was verified by polymerase chain reaction amplification of F or Fa.The inserted F and Fa were expressed in the two recombinants Lm-AactA-F and Lm-AplcB-Fa as shown bysodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot.Both recombinantsexhibited reduced virulence to embryonated eggs and mice by about 1.5-2.5 logs as compared with theparent wild strain 10403S. They were also less invasive than strain 10403S (P<0.05). Chickens receiving therecombinant strains orally or intraperitoneally were partially protected from virulent NDV challenge possiblydue to enhancement of non-specific immunity because the antibody titers against the homologous virus strainor the recombinant truncated fusion protein were marginal. Further research is needed in other animal modelsto see if the low antibody response results from insufficient expression of the heterologous genes as a resultof failure of L. monocytogenes or its recombinants to persist or replicate in chickens.

关键词： Listeria monocytogenes homologous recofflbination Newcastle disease virvs fusion protein F heterologous gene expression immunogenicity

产黄曲霉毒素真菌双重荧光定量PCR检测技术的建立与应用

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中国粮油学报 2024年第2期39卷 188-195页

作者：陈冠果李可陆金虎金晨晨王龑帅江冰鲍维琪程昌勇宋厚辉张晓峰浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地中澳动物健康大数据分析联合实验室杭州311300 浙江省检验检疫科学技术研究院杭州310016 浙江工业大学食品科学与工程学院杭州310014

为实现产黄曲霉毒素真菌的快速检测,本研究建立了检测产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因的双重荧光定量PCR方法。分别针对aflR基因和nor-l基因保守序列,各设计2对特异性引物和探针,通过引物对间的有效性实验各筛选出1对最优的aflR... 详细信息

为实现产黄曲霉毒素真菌的快速检测,本研究建立了检测产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因的双重荧光定量PCR方法。分别针对aflR基因和nor-l基因保守序列,各设计2对特异性引物和探针,通过引物对间的有效性实验各筛选出1对最优的aflR引物探针和nor-1引物探针,随后建立并优化双重荧光定量PCR的反应条件,构建标准曲线,测定该方法的重复性、灵敏度和特异性。结果显示,成功筛选出aflR-2和nor1-2 2组引物/探针组合,并优化和确定了引物/探针的最佳反应终浓度。特异性实验结果显示,本研究建立的检测方法仅对产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因呈现特异性扩增,对黑曲霉、碳黑曲霉、赭曲霉和镰刀菌等常见产毒真菌的核酸样品均无扩增曲线。建立的方法重复性好,批内和批间变异系数均<3%,双重反应体系的检测灵敏度均低至1×10^(2)copies/μL。利用本研究所建立的方法与ELISA试剂盒分别对80份食品样品进行检测,结果显示,双重荧光定量PCR共检测出9份阳性样品,而ELISA试剂盒只检测出了7份阳性,表明本研究建立的方法具有更高的灵敏度和准确性。

关键词：产黄曲霉毒素真菌双重荧光定量PCR 快速检测

Validation of an internally controlled multiplex real time RT-PCR for detection and typing of HEV genotype 3 and 4

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Validation of an internally controlled multiplex real time R...

Simultaneous detection of Nosema bombycis,nucleopolyhedrovirus and densovirus by multiplex real-time PCR in Bombyx mori

第六届中国兽药大会

作者： jiangbing shuai Yongqiang He Hongfei Mo Ruoxue Zeng Xiaofeng Zhang Zhejiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau

Hepatitis E virus(HEV) genotypes 1 and 2 are restricted to humans,whereas genotypes3(HEV 3) and genotype 4(HEV 4) infect humans and a variety of animal species.Cross-species infections by animal strai

关键词：

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Simultaneous detection of Nosema bombycis,nucleopolyhedrovir...

六种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测体系的构建

第六届中国兽药大会

作者： Yongqiang He Shan Wu Xingmeng Lu jiangbing shuai Hongfei Mo Ruoxue Zen Chenchen Jin Huizhen Yu Zhejiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Institute of Sericulture and Apiculture Zhejiang University

An effective,multiplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of three major pathogens,Nosema bombycis(BmNb),nucleopolyhedrovirus(NPV) and densovirus(DNV),in B.mori was developed in this s

关键词：

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微生物学报 2023年第9期63卷 3653-3666页

作者：张晓峰宋士琦曾若雪陈吴健莫虹斐王正亮帅江冰杭州海关技术中心浙江杭州311202 浙江省检验检疫科学技术研究院浙江杭州310016 中国计量大学生命科学学院浙江杭州310018

【目的】建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)多目标检测方法,同时对SIV进行通用型、H1型及H3型分型检测。【方法】本研究根据6种病原体基因的保守序列,设计了6对加标引物及对应的延伸探针并进行单反应试验。通过体系优化引物浓度和反应条件,以及方法特异性、重复性及灵敏度分析,使用MALDI-TOF MS检测方法及荧光定量PCR方法分别对临床样本和猪源产制品进行检测,并对结果进行对比验证。【结果】质谱结果显示,6种产物峰仅在靶标病毒对应的产物位置出现峰值,其他常见猪病病原在质谱图像中均未出现干扰,表明该体系的特异性良好。体系中每种病毒在高、中、低浓度时的批内阳性符合率均为100%,批间符合率均≥96.7%,表明该体系的重复性良好。灵敏度分析结果显示,体系中各病毒最低检测限在6.73–21.25拷贝/μL范围。应用MALDI-TOF MS多重检测方法对124份组织、饲料及猪肉样品进行检测,检出PRRSV阳性样本9份,SIV阳性样本3份(其中SIV-H1阳性样本2份,SIV-H3阳性样本1份)。将以上结果与荧光定量PCR方法分析结果进行对比验证,2种方法对各病原体检测结果的总符合率可达到99.2%–100%。【结论】本研究建立的6种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测方法为相关疫病监测和快速鉴别,以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。

关键词：猪呼吸道病毒基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 高通量检测

猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白免疫原性的鉴定和应用及其多抗在PCV2感染诊断中的应用(英文)

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微生物学报 2008年第1期48卷 85-90页

作者：帅江冰李肖梁陈宁陈雪燕方维焕浙江大学动物预防医学研究所浙江省动物预防医学重点实验室杭州310029

猪圆环病毒2型ORF2编码与病毒毒力相关的结构蛋白——核衣壳蛋白(Cap),该蛋白可以用于PCV2感染的血清学调查,但不同区域的PCV2分离株的ORF2特别是其抗原表位序列存在一定的突变。本研究将PCV2浙江分离株ORF2的主要抗原表位以及PCV1ORF2... 详细信息

猪圆环病毒2型ORF2编码与病毒毒力相关的结构蛋白——核衣壳蛋白(Cap),该蛋白可以用于PCV2感染的血清学调查,但不同区域的PCV2分离株的ORF2特别是其抗原表位序列存在一定的突变。本研究将PCV2浙江分离株ORF2的主要抗原表位以及PCV1ORF2进行了原核表达,将分别纯化的融合蛋白Cap2s和Cap1s免疫SPF兔后制备多抗,并进一步分析了纯化蛋白的免疫原性和多抗的特性。Western blot结果表明无论Cap2s和Cap1s均能与两个多抗发生交叉反应,而PCV2或PCV1阳性猪血清只能分别特异性地识别Cap2s和Cap1s。IFA结果则证明两个多抗对于天然Cap蛋白无交叉反应性。利用Cap2s作为包被抗原对13个猪场的259份血清样品的PCV2抗体进行ELISA检测,平均阳性率为80.69%(209/259),而各猪场的阳性率差异较大(48.28%～100%)。以上结果表明Cap2s可作为一个型特异性抗原用于浙江省本地猪场猪群血清中PCV2抗体的监控,而其多抗也可用于免疫组化对PCV2感染进行有效诊断。

关键词：猪圆环病毒核衣壳蛋白免疫原性间接免疫荧光血清阳性率

荧光扫描法快速检测肽核酸分子信标标记的单增李斯特菌

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微生物学报 2016年第7期56卷 1105-1112页

作者：吴姗张晓峰帅江冰李可虞惠贞金晨晨浙江省检验检疫科学技术研究院浙江杭州310016

【目的】建立了单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,单增李斯特菌)的肽核酸(Peptide nucleic acid,PNA)分子信标(Molecular beacon)的荧光扫描检测方法,以简化普通PNA原位荧光杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)检测方法中显微镜观察步骤。【方法】在具有单增李斯特菌特异性的肽核酸探针的5′和3′分别标记报告荧光基团和淬灭基团形成分子信标PNA探针,利用FISH技术和荧光扫描技术对单增李斯特菌进行检测。【结果】用普通PNA探针进行荧光扫描检测时,以N1处理为空白对照,假阳性率11.4%,假阴性率为0;以N2处理为空白时,假阳性率降低至4.3%,但假阴性率上升为18.6%。用分子信标PNA探针进行检测时,用N1为空白对照时,假阳性率8.6%,假阴性率为1.4%;以N2处理作为空白时,假阳性率5.7%,假阴性率为1.4%。与普通探针比较,分子信标PNA探针能有效减少假阳性和假阴性的发生。2种普通PNA探针的杂交成功率分别为83.3%和95.2%;2种"分子信标化"的肽核酸探针的成功率分别为91.7%和90.5%,表明探针两端标记并不会降低与目标菌的杂交成功率。【结论】将液相PNA-FISH和荧光扫描技术结合,通过大通量快速的荧光扫描检测可大幅提高检测效率。同时将肽核酸探针分子信标化,有效的降低了荧光扫描结果的假阳性,并通过了N1和N2两种空白对照处理把假阴性控制在较低的范围。

关键词：肽核酸荧光原位杂交分子信标荧光扫描单增李斯特菌

双通道荧光PCR快速检测水产品中主要致病性弧菌的研究

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中国食品学报 2011年第5期11卷 151-157页

作者：帅江冰傅玲琳张晓峰励建荣浙江出入境检验检疫局杭州310012 浙江工商大学食品与生物工程学院浙江省食品安全重点实验室杭州310035

目的:建立水产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌快速、敏感、特异的双通道荧光PCR同步鉴别体系。方法:针对副溶血弧菌TDH基因和霍乱弧菌ctxA基因设计合成2对特异性引物和2条Taqman探针,优化体系,建立双通道荧光PCR体系。结果:建立的双通道荧光... 详细信息

目的:建立水产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌快速、敏感、特异的双通道荧光PCR同步鉴别体系。方法:针对副溶血弧菌TDH基因和霍乱弧菌ctxA基因设计合成2对特异性引物和2条Taqman探针,优化体系,建立双通道荧光PCR体系。结果:建立的双通道荧光PCR体系特异性强,引物和探针之间无干扰。对副溶血弧菌和霍乱弧菌的检测灵敏度高,下限均能达到5×104CFU/mL。体系稳定,重复性好,可操作性强,两种不同浓度基因组DNA无相互抑制现象,适用于不同条件、多种样品的检测。采用该方法对140份采自舟山、象山和杭州的各类水产品进行检测,副溶血弧菌和霍乱弧菌检出率分别为25.7%和3.6%,未见霍乱弧菌和副溶血弧菌混合污染的样品,表明建立的双重荧光PCR是一种可用于水产品等样品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的快速、灵敏、特异的鉴别方法。

关键词：副溶血弧菌霍乱弧菌双通道荧光PCR Taqman探针

基于竞争性杂交方法的猪-肠道微生物特异性互作靶点发掘

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2017年第2期43卷 163-172页

作者：樊丽华莫虹斐张晓峰帅江冰陈青浙江工商大学食品与生物工程学院杭州310035 浙江省检验检疫科学技术研究院杭州310016

动物肠道中存在着一些参与猪肠道微生物互作的基因,这些基因具有一定的宿主特异性,利用其设计分子标记能准确识别粪便污染来源。该文共采集6个物种(猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅)的145个粪便样品,提取其DNA后利用竞争性杂交的基因片段富集方... 详细信息

动物肠道中存在着一些参与猪肠道微生物互作的基因,这些基因具有一定的宿主特异性,利用其设计分子标记能准确识别粪便污染来源。该文共采集6个物种(猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅)的145个粪便样品,提取其DNA后利用竞争性杂交的基因片段富集方法(genome fragment enrichment,GFE),靶向筛选参与猪肠道微生物互作的特异性基因。经BLASTX分析发现,82%的猪特异性非冗余DNA片段存在相似序列,以拟杆菌纲(Bacteroidetes)(43.2%)、梭菌纲(Clostridia)(19.5%)、芽孢杆菌纲(Bacilli)(8.6%)相似序列为主。从蛋白质功能方面分析,61.5%的非冗余序列功能明确,有7.6%的序列与信息贮存及加工有关,12.8%的序列与细胞加工及信息传导有关,22%的序列与代谢有关,其中,碳水化合物和氨基酸的转移代谢相关序列含量最为丰富,均占总特异性序列的6.3%。研究发现,能够编码拟杆菌纲(Bacteroidetes)和梭菌纲(Clostridials)等表面蛋白、膜分泌蛋白及碳水化合物代谢蛋白的相关基因可作为猪特异性分子标记筛选的靶点。

关键词：非点源污染竞争性杂交特异性基因组片段富集功能注释猪特异性分子标记