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猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立

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中国畜牧兽医 2024年第7期51卷 3056-3066页

作者：欧云文潘琴汪洋代军飞任绍科张洋翟佳佳张杰开江县动物疫病预防控制中心达州636250 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室秦皇岛066004

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段... 详细信息

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

关键词：猪圆环病毒3型(PCV3) Cap蛋白截短表达 ELISA

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石头埠水文站设计潮位计算分析

陕西水利 2024年第4期 25-28页

作者：潘嘉嘉刘惠雯覃新松肖大远广西沿海水文中心广西钦州535000

采用极值Ⅰ型分布计算石头埠水文站长系列潮水位资料,通过皮尔逊Ⅲ型分布参数估计法进行对比分析,提出最高潮水位和最低潮水位的设计值。计算分析结果可为铁山港附近海域的海堤工程、航道工程和海港工程等设计提供应用参考。

关键词：石头埠水文站铁山港湾设计潮位极值Ⅰ型分布

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75份青稞种质的品质性状综合评价

麦类作物学报 2024年第7期44卷 855-864页

作者：刘雅洁李茂李超李文博田敏潘佳佳赵辉余国武冯宗云四川农业大学农学院四川温江611130

为有效利用青稞种质资源、促进专用型品种的选育,利用主成分分析和因子分析法对75份青稞品种(系)在3个生态点的籽粒中蛋白质、γ-氨基丁酸、总淀粉、β-葡聚糖和花青素含量共5个籽粒品质性状进行分析与评价。结果显示,基因型、生态点及... 详细信息

为有效利用青稞种质资源、促进专用型品种的选育,利用主成分分析和因子分析法对75份青稞品种(系)在3个生态点的籽粒中蛋白质、γ-氨基丁酸、总淀粉、β-葡聚糖和花青素含量共5个籽粒品质性状进行分析与评价。结果显示,基因型、生态点及生态点与基因型互作对5个被测性状均有显著影响,5个性状的变异系数为3.88%~118.92%,广义遗传率为15.29%~90.13%,其中蛋白质、β-葡聚糖和花青素含量的广义遗传率大于60%,表明遗传是其含量差异的主要原因。利用主成分分析可将5个性状简化为3个公因子,其携带总信息量的73.73%。经过Promax旋转后的载荷结果显示,3个公因子分别反映青稞籽粒的氨基酸累积量、次生代谢物累积量和多糖累积量。加权评分后的综合排名和分层聚类结果显示,勾芒青稞、龙中紫、2009-119、XQ0168、次玛、4TH HBSNS-57、813、长芒黑青稞、白勾芒、耐那、对芒黑青稞、褐青稞、北青4号、白青稞和昆仑14号共15个材料的综合品质较好;单性状优势的统计分析结果表明,高蛋白育种适宜选用龙中紫,低β-葡聚糖育种适宜选择白勾芒、对芒黑青稞和褐青稞,高蛋白质且低β-葡聚糖含量育种适宜选择2009-119和XQ0168,高γ-氨基丁酸和高花青素育种适宜选择次玛,高γ-氨基丁酸和低葡聚糖育种适宜选择4TH HBSNS-57。

关键词：青稞综合评价主成分分析因子分析分层聚类

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猪流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医学报 2024年第4期44卷 651-656页

作者：黄书梁海英曾智勇汤德元王彬叶泥边孟婷柳佳佳潘向英田红利贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

参照GenBank登录的猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)基质蛋白(matrix protein,M)基因保守序列设计1对特异性引物和1个TaqMan探针,构建重组质粒作为绝对定量模板,通过优化反应体系及条件建立了检测SIV的荧光定量RT-PCR方法,测试了... 详细信息

参照GenBank登录的猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)基质蛋白(matrix protein,M)基因保守序列设计1对特异性引物和1个TaqMan探针,构建重组质粒作为绝对定量模板,通过优化反应体系及条件建立了检测SIV的荧光定量RT-PCR方法,测试了该方法的特异性、灵敏度及重复性。结果显示,建立的方法与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒等不存在交叉反应,特异性强;最低检测限度为1.0拷贝/μL,比普通RT-PCR方法灵敏10倍;组内和组间重复性试验的变异系数分别在2.2%和1.9%以下,重复性较好;应用该方法对220份临床疑似猪流感样品进行检测,荧光定量RTPCR方法和普通RT-PCR检测率分别为2.7%和1.8%,阳性符合率为100%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可快速检测样品中的各种SIV,从而更好地诊断和监测猪流感。

关键词：猪流感病毒 TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法

贵州1株G9P[23]型猪A群轮状病毒的分离鉴定及基因组序列分析

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中国兽医学报 2024年第5期44卷 900-906,913页

作者：柳佳佳梁海英曾智勇汤德元王彬叶泥边孟婷黄书田红利潘向英贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

为了解贵州省G9型猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的基因组特征和遗传进化关系,本试验对送检腹泻仔猪的肠内容物和粪样进行病原检测,选取G9型PoRV阳性样品通过Vero细胞进行分离培养及病毒鉴定,并对分离毒株进行基因组遗传变异分析。结果显示,... 详细信息

为了解贵州省G9型猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的基因组特征和遗传进化关系,本试验对送检腹泻仔猪的肠内容物和粪样进行病原检测,选取G9型PoRV阳性样品通过Vero细胞进行分离培养及病毒鉴定,并对分离毒株进行基因组遗传变异分析。结果显示,阳性样品经胰酶预处理后接种至Vero细胞,盲传至第15代出现稳定CPE,前期细胞变圆后固缩、脱落,后期胞浆界限不清,出现拉网现象,用特异性引物对细胞培养物进行RT-PCR鉴定,成功扩增341 bp的目的条带。细胞培养物的间接免疫荧光鉴定显示有特异性绿色荧光反应,电镜观察下可见晶格状排列的无囊膜病毒粒子,大小约70 nm,表明成功分离到1株PoRV,将之命名为GZZY2021。病毒增殖曲线结果显示,用GZZY2021株感染细胞后,0~12 h病毒含量最低,12~30 h病毒增殖速度最快,30~48 h病毒增殖速度较平缓,48 h病毒滴度达到峰值(10-5.60/0.1 mL),而后进入稳定期。全基因组克隆测序分析结果显示,GZZY2021分离株基因组全长为18 506 bp, 11个基因最相似序列同源性均>95.00%,VP1、VP2、VP4、VP7、NSP1、NSP3、NSP4基因与猪源毒株同源性最高,VP3基因与大熊猫源毒株相似性最高,VP6、NSP2、NSP5基因与人源毒株同源性最高,提示分离株为三元重配毒株,完整的基因型为G9-P[23]-I1-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1。VP4、VP7基因与同型参考毒株相比,分别发生5、3处独有氨基酸位点变异;与NX疫苗株的中和表位分别存在22、4处氨基酸位点差异。重组分析结果显示,GZAS2020株的NSP5基因是以PTR(FJ422141.1)为主要亲本毒株,A411(EF990694.1)为次要亲本毒株重组产生的毒株,重组断点位于121和321 bp。综上所述,本研究应用Vero细胞成功分离到1株G9P[23]型基因重配PoRV,不但可对持续监测贵州省PoRV的流行动态趋势提供研究数据,而且对筛选该领域的候选疫苗株以及该病的深入研究打下基础。

关键词：猪A群轮状病毒分离鉴定序列分析

猪圆环病毒2d亚型贵州株的分离鉴定及小鼠感染试验

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中国兽医科学 2024年第6期54卷 777-783页

作者：边孟婷梁海英曾智勇汤德元王彬叶泥柳佳佳黄书潘向英田红利贵州大学动物科学学院

为了鉴定贵州省某猪场疑似患猪皮炎肾病综合征（PDNS）的猪圆环病毒2型（PCV2），将经qPCR检测为PCV2阳性的病猪血清，无菌处理后接种PK-15细胞进行PCV2分离，采用间接免疫荧光（IFA）、PCR及全基因组克隆测序进行鉴定，用相关生物学软... 详细信息

为了鉴定贵州省某猪场疑似患猪皮炎肾病综合征（PDNS）的猪圆环病毒2型（PCV2），将经qPCR检测为PCV2阳性的病猪血清，无菌处理后接种PK-15细胞进行PCV2分离，采用间接免疫荧光（IFA）、PCR及全基因组克隆测序进行鉴定，用相关生物学软件对该PCV2进行遗传进化分析并了解其在PK-15细胞上的增殖情况及TCID50，用分离的毒株人工感染BALB/c小鼠，研究其感染性。结果显示，接种F9代病毒的PK-15细胞出现特异性绿色荧光；病毒液的PCR检测结果为PCV2阳性；全基因组克隆测序结果显示，该PCV2全长为1 767 bp，将其命名为PCV-2 GZGD2022；分离毒株与PCV2d参考株在进化树中处于同一分支；F9代与F1代病毒全基因组序列核苷酸相似性达99.7%，与参考毒株相似性在94.1%～98.7%之间；F9代较F1代病毒基因组出现6处核苷酸突变（G155A、G669A、T1474C、T1500C、A1518G、C1572T），在Cap蛋白中有3处突变（F77L、L227P、Y233C），在Rep蛋白中有1处突变（Y195H）；该PCV2d可在PK-15细胞中稳定增值；分离株的TCID50为10-4.75/0.1 m L；该分离毒株对小鼠肺、淋巴结有较强的侵袭力。本试验从PK-15细胞中成功分离得到1株稳定增殖的PCV2d毒株，研究结果为PCV2后续病原学研究奠定一定基础，为PCV2疫苗株筛选提供了材料。

关键词：猪圆环病毒2型猪皮炎肾病综合征分离鉴定小鼠感染试验

猪圆环病毒2型ORF9蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

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中国兽医科学 2024年第2期54卷 226-232页

作者：边孟婷梁海英曾智勇汤德元王彬叶泥柳佳佳黄书潘向英田红利贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

为了鉴定并深入研究ORF9蛋白在猪圆环病毒2型感染中的作用,本研究制备了小鼠抗ORF9蛋白多克隆抗体并进行了初步应用。首先通过扩增克隆ORF9基因,构建原核表达质粒pET-32a(+)-PCV2-ORF9并转化至BL21(DE3)感受态细胞中,再利用SDS-PAGE对... 详细信息

为了鉴定并深入研究ORF9蛋白在猪圆环病毒2型感染中的作用,本研究制备了小鼠抗ORF9蛋白多克隆抗体并进行了初步应用。首先通过扩增克隆ORF9基因,构建原核表达质粒pET-32a(+)-PCV2-ORF9并转化至BL21(DE3)感受态细胞中,再利用SDS-PAGE对可能影响ORF9蛋白表达效果的因素(温度、IPTG浓度、时间)进行优化研究,随后将重组蛋白经纯化复性后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定小鼠多抗效价,并用IFA和Western-blot方法对抗ORF9多克隆抗体特异性进行研究。结果显示,重组质粒p ET-32a(+)-PCV2-ORF9构建成功;ORF9重组蛋白在IPTG浓度为0.1 mmol/L、37℃条件下诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达,分子量大小约24.2 ku;经ELISA检测制备的多抗效价为1∶6 400;IFA和Western-blot试验结果均证明ORF9蛋白能被PCV2阳性血清和小鼠多克隆抗体特异性识别。本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV2 ORF9重组蛋白,制备的特异性抗PCV2 ORF9多克隆抗体为探究ORF9蛋白在PCV2感染中的作用奠定了基础材料。

关键词：猪圆环病毒2型 ORF9蛋白原核表达多克隆抗体

猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2024年第2期54卷 162-168页

作者：柳佳佳梁海英曾智勇汤德元王彬叶泥边孟婷黄书田红利潘向英贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标... 详细信息

根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.1139x+39.298,R^(2)=0.9937,E=109.5%;用该方法检测猪常发传染病病原时结果均为阴性;对标准品质粒的最低检测限为1.32 copies/μL;批内、批间变异系数分别小于0.600%、1.300%,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用该方法检测114份临床腹泻病料,阳性检出率(39/114)优于常规RT-PCR(22/114),39份阳性样品经测序鉴定均为Po RV,扩增VP7基因后成功构建22份阳性质粒,测序结果显示共检出6种G型Po RV,检出率依次为9.09%(G3)、22.72%(G4)、18.18%(G5)、31.82%(G9)、4.54%(G11)、9.09%(G26)。上述结果表明,本试验建立了一种快捷、准确检出Po RV的Taq Man探针通用型实时荧光定量RT-PCR方法,对该病的诊断、病原监测、流行病学调查具有重要意义。

关键词：猪轮状病毒 TaqMan探针荧光定量RT-PCR

磷酸三丁酯、4-甲基-2戊酮对铝锂溶液中锂的萃取行为

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化学分析计量 2024年第3期33卷 94-98,104页

作者：李歆潘翠翠崔靖韩淑珍李佳佳白海香中核北方核燃料元件有限公司内蒙古包头014035

以磷酸三丁酯(TBP)作为主要萃取剂,4-甲基2-戊酮(MIBK)作为协助萃取剂,三氯化铁(FeCl3)作为共萃剂,以铝锂溶液体系作为试验对象,全面系统的研究了萃取剂的各组成成分、水相溶液的pH值、铁锂原子比、萃取相比、萃取时间以及静置时间对铝... 详细信息

以磷酸三丁酯(TBP)作为主要萃取剂,4-甲基2-戊酮(MIBK)作为协助萃取剂,三氯化铁(FeCl3)作为共萃剂,以铝锂溶液体系作为试验对象,全面系统的研究了萃取剂的各组成成分、水相溶液的pH值、铁锂原子比、萃取相比、萃取时间以及静置时间对铝锂溶液中锂的萃取效果的影响。通过正交试验确定了萃取反应的最佳反应参数:萃取相比为5∶2,铁锂原子比为2∶1,pH值为1.5,TBP体积分数为70%,MIBK体积分数为15%,萃取时间为10 min。在此条件下,锂的单级萃取率可达82%,锂铝单级分离因数可达51。对萃取分离过程的反应机理进行了研究,深入探索了铁锂共萃取效应,确定了反应产生的萃合物形态为LiFeCl4·2TBP·MIBK,并探究了萃合物形成过程中的键合方式。该萃取方法经济高效,适用于铝锂溶液中锂的分离。

关键词：磷酸三丁酯 4-甲基-2戊酮萃取体系铝锂分离共萃取正交试验