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蓝舌病多克隆抗体C-EliSA检测方法的建立和比较研究

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云南农业大学学报（自然科学版） 2014年第1期29卷 58-62页

作者：苗海生李乐廖德芳杨永钦李华春云南省畜牧兽医科学院云南昆明650224

为建立一种检测成本低、操作简便的蓝舌病血清抗体监测方法,本研究通过制备群特异性的蓝舌病多克隆检测抗体和优化抗原固定技术,建立了蓝舌病多克隆抗体C-EliSA检测方法。通过对150份牛羊已知阴性血清的检测确定该检测方法的cut-off值为... 详细信息

为建立一种检测成本低、操作简便的蓝舌病血清抗体监测方法,本研究通过制备群特异性的蓝舌病多克隆检测抗体和优化抗原固定技术,建立了蓝舌病多克隆抗体C-EliSA检测方法。通过对150份牛羊已知阴性血清的检测确定该检测方法的cut-off值为40%;对58份已知阳性血清样品同时进行中和实验和C-EliSA检测,检测结果经SPSS软件进行t检测统计分析,Sig.(双侧)=0.651,相关性0.912,相关性显著。对24个BTV血清型阳性血清,2份牛BVD阳性血清,2份羊口蹄疫阳性血清,2份羊痘阳性血清进行检测。结果表明,24个BTV血清型阳性血清为阳性,其他血清全部为阴性。对150份已知阴性血清和55份已知阳性血清用中和试验、美国VMRD公司试剂盒和本方法分别进行检测。结果表明,本检测方法与中和试验检测结果符合率达100%,进口试剂盒符合率为96.7%。

关键词：蓝舌病多克隆抗体 blue-tongue-virus (BTV) competition EliSA (C-EliSA)

感染16型蓝舌病病毒后绵羊部分细胞因子消长特点研究

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中国畜牧兽医 2021年第1期48卷 296-302页

作者：苗海生寇美玲谢佳芮李乐李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

本试验旨在探明绵羊感染16型蓝舌病病毒(Bluetongue virus type 16,BTV16)后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的消长特点。用实时荧光定量PCR检测方法对感染BTV16后3只绵羊上述4种因子mRNA进行检测,同时设立阴性对照绵羊,并以0 d mRN... 详细信息

本试验旨在探明绵羊感染16型蓝舌病病毒(Bluetongue virus type 16,BTV16)后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的消长特点。用实时荧光定量PCR检测方法对感染BTV16后3只绵羊上述4种因子mRNA进行检测,同时设立阴性对照绵羊,并以0 d mRNA为基准,计算mRNA的相对表达量,同时检测病毒抗体效价、测量绵羊体温。结果显示,接种BTV16的3只绵羊均不同程度产生抗体和体温症状,4种细胞因子的mRNA在接种病毒2~4 d内均出现显著上升,其中IFN-γ峰值在2.58~27.84倍之间,IL-2峰值在5.24~17.19倍之间,IL-4峰值在2.16~3.43倍之间,IL-10峰值在15.78~48.77倍之间,个体上升幅度存在显著差异,4种细胞因子均在高水平持续6 d左右后逐渐下降。对照绵羊上述参数在正常范围内波动。本研究阐明了接种BTV16后绵羊细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10在转录水平上的消长特点,为进一步深入开展BTV感染特征、宿主机体免疫机制研究提供参考。

关键词： 16型蓝舌病病毒(BTV16) 细胞因子 mRNA 消长特点

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 395-400页

作者：杨恒李占鸿宋子昂高林李卓然廖德芳肖雷李华春昆明学院农学与生命科学学院昆明650214 云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224 南京农业大学动物医学院南京210095

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,... 详细信息

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

关键词：帕利亚姆病毒血清型鉴定实时荧光定量RT-PCR 检测方法

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东南亚十二节段RNA病毒荧光定量qRT-PCR和常规RT-PCR检测方法的建立

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中国动物传染病学报 2023年第1期31卷 98-105页

作者：杨振兴李占鸿李卓然李华春廖德芳杨恒云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

东南亚十二节段RNA病毒属为呼肠孤病毒科中的一个新属,该属包括版纳病毒(BAV)、芒市病毒(MSV)、卡皮罗病毒(KDV)和辽宁病毒(LNV)四种病毒。为建立上述四种病毒的群特异性核酸检测方法,本研究根据BAV、MSV、KDV和LNV毒株VP12基因序列的... 详细信息

东南亚十二节段RNA病毒属为呼肠孤病毒科中的一个新属,该属包括版纳病毒(BAV)、芒市病毒(MSV)、卡皮罗病毒(KDV)和辽宁病毒(LNV)四种病毒。为建立上述四种病毒的群特异性核酸检测方法,本研究根据BAV、MSV、KDV和LNV毒株VP12基因序列的保守区,设计特异性引物和TaqMan探针,建立了荧光定量qRT-PCR和常规RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、灵敏性和重复性的检测。实验结果表明,两种检测方法分别对四种病毒均有特异性的扩增和荧光信号检出,而对流行性出血病病毒(EHDV)、蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)、广西环状病毒(GXOV)、阿卡斑病毒(AKAV)、云南环状病毒(YUOV)等病毒无扩增和无有效荧光信号检出,具有较好的特异性。灵敏性实验结果显示,荧光定量qRT-PCR检测四种病毒核酸的下限可达10 copies/μL,常规RT-PCR的检测下限为10^(2) copies/μL,荧光定量方法灵敏度是常规方法的10倍。四种病毒荧光定量qRT-PCR方法的组内和组间重复试验标准差均小于0.8,变异系数均小于3%,表明该方法均具有良好的稳定性。以上结果表明,本研究建立的BAV、MSV、KDV和LNV四种病毒的荧光定量qRT-PCR和常规RT-PCR方法具有快速、准确、稳定等优点,可为四种病毒的早期诊断、快速检测、流行病学调查和实验研究等提供有效的技术方法。

关键词：版纳病毒芒市病毒卡地皮诺病毒辽宁病毒 RT-PCR 病毒检测

中国绿色创新效率的区域差异、动态演进及收敛性

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统计与决策 2025年第3期41卷 42-48页

作者：李继霞张灿王华春北京师范大学政府管理学院北京100875 北京市社会科学院综合治理研究所北京100029

文章基于创新价值链理论,运用包含非期望产出的网络SBM-DEA模型测度了2009—2020年中国30个省份的绿色创新效率,并利用Dagum基尼系数、核密度估计和收敛模型探究其区域差异、动态演进和收敛性特征。结果表明:(1)中国整体绿色创新效率不... 详细信息

文章基于创新价值链理论,运用包含非期望产出的网络SBM-DEA模型测度了2009—2020年中国30个省份的绿色创新效率,并利用Dagum基尼系数、核密度估计和收敛模型探究其区域差异、动态演进和收敛性特征。结果表明:(1)中国整体绿色创新效率不高,且各阶段发展不平衡,存在“重研发,轻转化”的现象,其空间分布呈现“东部>中部>西部>东北”的格局。(2)中国绿色创新效率的总体差异、区域间差异、区域内差异和超变密度均呈下降趋势,区域间差异是总体差异的主要来源。(3)除东部地区外,全国及东北、中部和西部地区的绿色创新效率均存在多极分化现象。(4)中国绿色创新效率整体及三个阶段均存在收敛特征,且经济发展水平、财政支持力度、产业结构高级化等因素对绿色创新效率整体及三个阶段的变化率的影响具有显著差异。

关键词：绿色创新效率区域差异动态演进网络SBM-DEA

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十二种血清型蓝舌病病毒型特异性实时荧光定量RT⁃PCR定型方法的建立

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病毒学报 2021年第5期37卷 1158-1166页

作者：李占鸿杨振兴宋子昂李华春李卓然廖德芳杨恒云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224 云南农业大学动物医学院昆明650201

为建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)十二种血清型(血清6、8、10、11、13、14、17、18、19、20、22与23型)特异性实时荧光定量RT⁃PCR(qRT⁃PCR)检测方法,根据GenBank公布的十二种BTV血清型毒株的基因节段2序列,选择高度保守区域,设... 详细信息

为建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)十二种血清型(血清6、8、10、11、13、14、17、18、19、20、22与23型)特异性实时荧光定量RT⁃PCR(qRT⁃PCR)检测方法,根据GenBank公布的十二种BTV血清型毒株的基因节段2序列,选择高度保守区域,设计每种BTV血清型的扩增引物与TaqMan探针;以十二种血清型BTV参考毒株的cDNA为模板,进行引物的筛选,建立BTV血清型特异性qRT⁃PCR检测方法;对检测方法的灵敏度、特异性与重复性进行验证,分别以含有50、100与200个BTV噬斑形成单位(Plaque forming unit,PFU)的模拟BTV阳性血液样本为检测对象,进行检测效果的评估。实验结果表明,建立的BTV血清型特异性qRT⁃PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异性,对不同血清型BTV核酸拷贝数的检出下限在12拷贝/μL(BTV⁃8)至57拷贝/μL(BTV⁃14)之间;对我国反刍动物上广泛流行的流行性出血病病毒、中山病病毒与阿卡斑病毒核酸的检测结果均为阴性。反应具有良好的重复性,组内Ct值的变异系数在0.92%至1.96%之间,组间Ct值的变异系数在0.26%至1.62%之间。对模拟BTV阳性血液样本的检测结果显示,BTV血清型特异性qRT⁃PCR可有效检测含50个PFU(噬斑形成单位)的BTV血液样本。本研究建立的十二种BTV血清型特异性qRT⁃PCR定型方法具有特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染BTV血清型的诊断。

关键词：蓝舌病病毒(BTV) 血清型实时荧光定量RT⁃PCR 检测方法

中国蓝舌病病毒流行株血清型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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微生物学通报 2021年第8期48卷 2920-2932页

作者：宋子昂李占鸿杨振兴李卓然刘威李华春廖德芳杨恒云南农业大学动物医学院云南昆明650201 云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224 内蒙古自治区农牧业科学院内蒙古呼和浩特010031

【背景】蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,我国存在12种血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24)的流行。【目的】建立12种血清型BTV的RT-qPCR定型方法,为BTV的诊断与流... 详细信息

【背景】蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,我国存在12种血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24)的流行。【目的】建立12种血清型BTV的RT-qPCR定型方法,为BTV的诊断与流行病学研究提供技术保障。【方法】根据我国流行BTV基因节段2(Seg-2)序列设计引物和TaqMan探针,对引物的特异性与敏感性进行评估;以12种血清型BTV毒株和核酸阳性血液样本验证建立的血清型RT-qPCR检测方法;将其应用于库蠓与动物血液样本中BTV的定型。【结果】建立的BTV血清型RT-qPCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,反应的扩增效率(E)值>90.3%,相关系数(R2)值在0.991-0.999之间,对12种血清型BTV核酸的检测下限在25-48拷贝之间。对165株BTV的RT-qPCR定型结果与病毒的Seg-2测序鉴定结果一致;对194份采集于哨兵动物的BTV核酸阳性血液样本的RT-qPCR定型结果与感染动物上分离BTV的血清型一致。采用建立的方法,从2019年云南省师宗县与景洪市采集的库蠓与牛血液样本中鉴定出6种血清型的BTV(BTV-1、-2、-4、-5、-16和-24)。【结论】研究建立的12种BTV血清型RT-qPCR定型方法具有特异、敏感和省时的优点,可用于媒介与动物感染BTV的血清型定型,具有良好的应用与推广价值。

关键词：蓝舌病病毒血清型实时荧光定量RT-PCR 应用

蓝舌病病毒群特异性RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

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畜牧兽医学报 2021年第8期52卷 2244-2253页

作者：李占鸿朱沛宋子昂李卓然杨振兴李华春杨恒廖德芳云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒重点实验室昆明650224 云南农业大学动物医学院昆明650201

本研究旨在建立针对中国流行蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据我国分离BTV毒株Seg-5基因序列的高度保守区域,设计特异性引物,优化反应条件及反应体系,进行特异性及灵敏度验证,建立BTV R... 详细信息

本研究旨在建立针对中国流行蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据我国分离BTV毒株Seg-5基因序列的高度保守区域,设计特异性引物,优化反应条件及反应体系,进行特异性及灵敏度验证,建立BTV RT-LAMP检测方法;对46株中国分离的12种血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24)代表毒株进行检测,进一步对120份BTV核酸阳性血液样品及60份2020年采集自监控动物的临床血液样品进行BTV的RT-LAMP及qRT-PCR检测,验证建立的RT-LAMP检测方法的准确性和可靠性。试验结果表明,本研究建立的RT-LAMP方法最佳反应条件为64℃,扩增45 min;反应体系中外引物∶内引物:环引物的最佳浓度及比例为0.2μmol·L^(-1)∶0.6μmol·L^(-1)∶0.4μmol·L^(-1)。该方法可特异性检测中国流行的12种血清型BTV核酸,与动物流行性出血病病毒(EHDV)、中山病毒(CHUV)、阿卡斑病毒(AKAV)、口蹄疫病毒(FMDV)及非洲马瘟病毒(AHSV)核酸均无交叉扩增现象;最低可检测4.5拷贝·μL^(-1)的BTV核酸。对46株分属12种血清型的BTV代表毒株的检测结果均为阳性;120份BTV核酸阳性血液样品的检测结果与qRT-PCR检测结果无显著差别(McNemar检验P>0.05),符合率为95.0%;60份临床血液样品的检测结果与qRT-PCR结果完全一致,以上结果表明本研究建立的RT-LAMP方法准确可靠,对中国分离的BTV毒株及临床血液样品均具有良好的检测效果。本研究建立的BTV RT-LAMP检测方法具有反应快速、结果可视化、特异性强和敏感度高等优点,为我国开展BTV检测诊断与流行病学研究提供了技术支持,具有较好的应用前景。

关键词：蓝舌病病毒群特异性 RT-LAMP 应用

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一株新型云南牛环状病毒的分离鉴定

微生物学报 2021年第7期61卷 1957-1970页

作者：杨振兴李占鸿廖德芳高翔胡忠燕谢佳芮李华春杨恒云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224 景洪市动物疫病预防控制中心云南景洪666100

【目的】为加深云南省动物虫媒病毒多样性的认知。【方法】在云南省景洪市设立哨兵牛,定期采血接种细胞进行虫媒病毒的分离;通过RT-PCR、电镜观察与基因组琼脂糖凝胶电泳对分离病毒进行初步鉴定;扩增分离病毒的基因节段2(Seg-2)与基因节... 详细信息

【目的】为加深云南省动物虫媒病毒多样性的认知。【方法】在云南省景洪市设立哨兵牛,定期采血接种细胞进行虫媒病毒的分离;通过RT-PCR、电镜观察与基因组琼脂糖凝胶电泳对分离病毒进行初步鉴定;扩增分离病毒的基因节段2(Seg-2)与基因节段3(Seg-3)全长序列进行分析与系统发生树的构建,明确病毒的分类地位;通过qRT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。【结果】2019年7月,从哨兵牛上采集的血液中分离到1株可在BHK-21细胞上引起细胞病变的病毒;电镜下观察,病毒粒子呈球形,直径约70 nm;琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组由双链RNA组成,呈现“3-3-3”的带型特征。分离毒株的Seg-2编码环状病毒属病毒保守的T2蛋白,与Mobuck virus具有最近的亲缘关系,核酸与氨基酸序列相似度分别为72.8%与84.0%;分离毒株的Seg-3编码决定环状病毒属病毒血清型的OC1蛋白,与Mobuck virus的核酸与氨基酸序列相似度仅为60.2%与56.5%;在T2与OC1蛋白构建的系统发生树上,分离毒株形成独立于Mobuck virus的进化分支。对哨兵牛血液中的病毒核酸与血清中和抗体回溯分析结果显示,从病毒感染哨兵动物至监测期结束的17周内,动物血液中均可检测到病毒核酸;动物感染病毒1周后,开始产生特异性中和抗体,随后上升至最高水平(抗体效价1:226),至监测期结束,中和抗体仍维持在较高水平(抗体效价1:113)。【结论】本研究首次报道了1种新型Mobuck virus在云南省哨兵牛上的分离与感染特性。研究结果丰富了对我国环状病毒属病毒的认知,为开展病毒的诊断、流行病学与致病性研究奠定了基础。

关键词：环状病毒属病毒 Mobuck 病毒病毒分离与鉴定进化分析感染动态分析