检索结果-南通市图书馆

结核病与胸部肿瘤 2020年第2期 87-94页

作者：李姝萍 ﹐王小珏 ﹐杨斌 ﹐王和林 ﹐闫卓红易玲 ﹐韦攀健﹐金鑫郝建清张洪涛北京市结核病胸部肿瘤研究所中心实验室 101149 首都医科大学附属北京胸科医院肿瘤免疫室 101149

目的构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-l.)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法人PD-l.-Fc蛋白免疫BAl./c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-l.特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联... 详细信息

目的构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-l.)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法人PD-l.-Fc蛋白免疫BAl./c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-l.特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(El.SA)和Western bl.t检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(singl.-chain variabl. fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5RACE技术扩增其轻链和重链可变区(Vl.VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-l.-scFv借助2A序列连接,克隆人慢病毒pl.X-EF1.-RES-ZsGreen1表达载体,使用l.nt-X Packagng Singie Shots(VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,El.SA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-l.l.scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果获得PD-l.抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10^-10 mol.),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-l.双修饰慢病毒分泌型CAR(CTCO537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-l.-SeFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-l.-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。结论成功构建了EGFR-CAR和PD-l.-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-l.抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。

关键词： EGFR-CAR PD-l.-scFv 膜表达型分泌表达型合成生物技术

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