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广东省蒲瓜病毒种类鉴定及多重RT-PCR检测方法的建立

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中国农业科学 2023年第23期56卷 4684-4695页

作者：苏琦汤亚飞佘小漫蓝国兵于琳吴正伟李正刚何自福广东海洋大学滨海农业学院广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类，建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法，提高蒲瓜病毒种类鉴定效率，为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间，从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和... 详细信息

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类，建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法，提高蒲瓜病毒种类鉴定效率，为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间，从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份，对采集的样品按照地区和症状进行分类，提取每份样品的总RNA，将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果，设计特异引物进行RT-PCR验证，从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒，根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物，通过优化反应体系和反应条件，建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中，共检测到12种病毒，按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒（Lagenaria siceraria alphaendornavirus,LSEV）(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）(62.8%)、小西葫芦虎纹花叶病毒（zucchini tigre mosaic virus,ZTMV）(51.3%)、西瓜绿斑驳花叶病毒（watermelon green mottle mosaic virus,WGMMV）(43.6%)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)(32.1%)、番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）(19.2%)、小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）(9.0%)、瓜类蚜传黄化病毒（cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV）(7.7%)、中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus,SLCCNV）(7.7%)、瓜类褪绿黄化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）(5.1%)、瓜类黄矮失调病毒（cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV）(3.8%)、甜瓜黄斑病毒（melon yellow spot virus,MYSV）(1.3%)。78份样品中，复合侵染率高达80.8%，其中2、3、4、5、6和7种病毒复合侵染的检出率分别为14.1%、16.7%、23.1%、17.9%、7.7%和1.3%。在多重RT-PCR体系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物，12个反应后再加入CGMMV+WGMMV引物，引物体积依次为WVA 0.5μL、CCYV 0.5μL、CGMMV 0.4μL、WGMMV 0.4μL、ZTMV 0.6μL、PRSV 0.6μL，从而确立了一种同时扩增6种病毒的多重RT-PCR检测方法。【结论】危害广东省蒲瓜的主要病毒有12种，其中CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA为优势病毒；复合侵染现象较普遍，以3、4和5种病毒的复合侵染形式占比较高；研发出一种同时检测蒲瓜上6种病毒的多重RT-PCR检测技术，提高了蒲瓜病毒种类鉴定效率。

关键词：蒲瓜病毒病小RNA深度测序 RT-PCR检测多重PCR方法

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霸王花褐腐病的病原鉴定

华南农业大学学报 2014年第1期35卷 60-63页

作者：蓝国兵何自福罗方芳汤亚飞佘小漫杜振国广东省农业科学院植物保护研究所广东广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广东广州510640

【目的】明确导致广东省霸王花Hylocereusundatus褐腐病的病原种类．【方法】通过病组织分离、致病性测定、形态学观察及rDNA序列分析等方法对广东省霸王花褐腐病病原进行了种类鉴定．【结果和结论】在PDA培养基上，病原菌的菌落为深灰... 详细信息

【目的】明确导致广东省霸王花Hylocereusundatus褐腐病的病原种类．【方法】通过病组织分离、致病性测定、形态学观察及rDNA序列分析等方法对广东省霸王花褐腐病病原进行了种类鉴定．【结果和结论】在PDA培养基上，病原菌的菌落为深灰色，绒毛状．产生2种类型的节孢子：一种为浅色、薄壁的柱状孢子，大小为（5．00—10．69）μm×（2．61～4．52）μm；另一种为褐色、厚壁、圆形或椭圆形、基部平截、成链的孢子，大小为（5．15～12．39）μm×（3．87～6．07）um．应用真菌通用引物ITSI和ITS4进行PCR，获得该病原菌579bp的18S-28SrDNAITS序列．BLAST结果显示，该序列与Neoscytalidiumdimidiatum火龙果菌株的18S-28SrDNAITS序列相似性最高，为99％-100％．这些研究结果表明，引起广东省霸王花褐腐病的病原菌为***．

关键词：霸王花褐腐病病原鉴定

侵染构树的菜豆金色黄花叶病毒属病毒的鉴定及基因组序列分析

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植物病理学报 2024年第1期54卷 59-68页

作者：汤亚飞李正刚佘小漫于琳蓝国兵丁善文何自福广东省农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

从广东省河源市连平县采集3份疑似双生病毒侵染引起的叶片表现黄花叶症状构树样品,提取总DNA,利用Bego-movirus通用引物AV494/CoPR进行PCR检测表明,疑似病样中均检测到菜豆金色黄花叶病毒属病毒。进一步选取PCR检测为阳性的样品进行RCA... 详细信息

从广东省河源市连平县采集3份疑似双生病毒侵染引起的叶片表现黄花叶症状构树样品,提取总DNA,利用Bego-movirus通用引物AV494/CoPR进行PCR检测表明,疑似病样中均检测到菜豆金色黄花叶病毒属病毒。进一步选取PCR检测为阳性的样品进行RCA扩增、酶切、克隆及测序,获得侵染广东构树的病毒分离物基因组全长序列。广东构树分离物(GS-2021)为一个双组分病毒,包含DNA-A和DNA-B两组分。DNA-A组分(GS-2021-A)全长为2777 nt,编码7个ORFs;DNA-B组分(GS-2021-B)为2742 nt,编码2个ORFs。GS-2021与已报道的中国大青金色花叶病毒(clerodendrum golden mosaic China virus,ClGMCNV)各分离物的DNA-A、DNA-B均有较高的一致性,全长序列的一致性分别为93.0%~93.9%和86.3%~89.6%,其中与福建Fz7分离物DNA-A(GenBank登录号:FJ011668)和DNA-B(GenBank登录号:FJ011669)的相一致性最高,为93.9%和89.6%。GS-2021与ClGMCNV福建、浙江、江苏和美国的5个分离物亲缘关系近,同属一个分支,其中与福建Fz7分离物聚集在一个小分支,亲缘关系最近。基因重组分析显示,GS-2021无明显的基因重组事件存在。根据ICTV对菜豆金色黄花叶病毒属病毒最新分类标准,GS-2021属ClGMCNV的一个新株系。本研究首次在构树上检测到菜豆金色花叶病毒属病毒,获得其病毒基因组全序列,明确其为ClGMCNV的新株系。因此,构树是菜豆金色黄花叶病毒属病毒的新自然寄主。

关键词：构树菜豆金色黄花叶病毒属中国大青金色花叶病毒病毒基因组新寄主

广东烟粉虱传双生病毒的发生种类、分布及动态

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植物保护 2024年第4期50卷 255-263,275页

作者：汤亚飞李正刚蓝国兵佘小漫于琳丁善文何自福广东省农业科学院植物保护研究所农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

为了监测烟粉虱传双生病毒在广东的发生与扩散动态,2003年-2021年,本课题组对全省烟粉虱传双生病毒进行了长期调查与监测。结果表明,在广东省广州、湛江、惠州等14市均有烟粉虱传双生病毒病的发生,危害的寄主植物有番茄、南瓜、甘薯等24... 详细信息

为了监测烟粉虱传双生病毒在广东的发生与扩散动态,2003年-2021年,本课题组对全省烟粉虱传双生病毒进行了长期调查与监测。结果表明,在广东省广州、湛江、惠州等14市均有烟粉虱传双生病毒病的发生,危害的寄主植物有番茄、南瓜、甘薯等24种,其中番茄黄化曲叶病发生和危害尤为严重,广泛分布于全省各地;从14市采集的病样中共鉴定出烟粉虱传双生病毒21种,其中广东番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl Guangdong virus,TYLCGdV)、广东番茄曲叶病毒(tomato leaf curl Guangdong virus,ToLCGdV)、黄蝉曲叶病毒(Allamanda leaf curl virus,AllLCV)、广东雾水葛花叶病毒(Pouzolzia mosaic Guangdong virus,PouMGDV)、十萼茄黄花叶病毒(Lycianthes yellow mosaic virus,LyYMV)5种病毒为新种;同时,发现危害不同寄主的病毒种类存在差异,危害同一作物的病毒种类也存在动态变化。本文明确了广东烟粉虱传双生病毒分布广、种类多、危害重,为全省烟粉虱传双生病毒病的防控提供了科学依据。

关键词：烟粉虱传双生病毒广东发生分布种类

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侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征及致病性分析

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中国农业科学 2020年第5期53卷 955-964页

作者：李正刚农媛汤亚飞佘小漫于琳蓝国兵邓铭光何自福广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并... 详细信息

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列(GenBank登录号:KX883801)设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F:CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R:TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F:AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R:AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F:GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R:GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶(61—3 495 nt)、186K复制相关蛋白(61—5 007 nt)、运动蛋白MP(4 994—5 788 nt)和外壳蛋白CP(5 763—6 248 nt)。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物(GenBank登录号:KY753928)同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。

关键词：葫芦黄瓜绿斑驳花叶病毒分子特征侵染性克隆致病性

海南省东方市东亚飞蝗发生情况及综合防治措施

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热带农业科学 2019年第9期39卷 46-50页

作者：周洋佘小漫金宝红何自福海南省东方市农业服务中心海南东方572600 广东省农业科学院植物保护研究所广东广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广东广州510640

东亚飞蝗属直翅目飞蝗科飞蝗属昆虫,具有迁飞性、爆发性,是农业生产上危害性极大的害虫。本文概述了海南省东亚飞蝗发生情况,阐述了东方市蝗区的分布,总结了2012~2018年蝗虫发生危害情况,分析了东亚飞蝗生活习性及发生规律;在此基础上,... 详细信息

东亚飞蝗属直翅目飞蝗科飞蝗属昆虫,具有迁飞性、爆发性,是农业生产上危害性极大的害虫。本文概述了海南省东亚飞蝗发生情况,阐述了东方市蝗区的分布,总结了2012~2018年蝗虫发生危害情况,分析了东亚飞蝗生活习性及发生规律;在此基础上,提出了东亚飞蝗的综合防控体系,包括成立防蝗指挥部,加强监测预警,开展技术培训,分类指导防治,为海南东亚飞蝗的防控提供了参考。

关键词：东亚飞蝗东方市发生规律综合防控

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染广东辣椒的病毒种类

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中国农业科学 2019年第13期52卷 2256-2267页

作者：汤亚飞裴凡李正刚佘小漫于琳蓝国兵邓铭光何自福广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛... 详细信息

【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名和韶关8市辣椒主要种植区采集疑似病毒病辣椒样品125份,分别提取每份辣椒病样总RNA,对从茂名、梅州、韶关3市采集的病样按地点和症状混合成7份混合病样进行小RNA深度测序分析,根据小RNA深度测序分析结果,对每种病毒分别根据小RNA深度测序拼接的基因片段序列和GenBank数据库中与该拼接序列同源性最高的病毒基因组序列保守区设计2对特异性引物,以小RNA深度测序的病样RNA为模板进行RT-PCR扩增,根据扩增效果对引物进行筛选,进一步应用筛选出的引物,对采集于广东省的125份辣椒病样分别进行RT-PCR检测,根据检测结果明确危害广东辣椒的病毒种类。【结果】从采集于广东省8市的辣椒主要种植区的125份病样中检测到14种病毒,按照检出率从高到低依次为辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)(44.0%)、甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus,BPEV)(32.8%)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)(31.2%)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)(29.6%)、辣椒黄脉病毒1(Pepper vein yellow virus 1,PeVYV-1)(26.4%)、甜椒斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)(25.6%)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)(18.4%)、辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)(16.8%)、辣椒黄脉病毒6(Pepper vein yellow virus 6,PeVYV-6)(16.8%)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)(15.2%)、辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus,Ca CV)(14.4%)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV-2)(9.6%)、辣椒隐症病毒1(Pepper cryptic virus 1,PCV1)(8.8%)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)(4.0%)。其中,PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6种病毒的检出率在25%以上,但PMMo V、Chi VMV和PVMV分布广泛,PMMo V除了茂名外,Chi VMV除了韶关外,其他7市辣椒产区均有分布;PVMV广泛分布于8市辣椒产区,根据检出率和分布范围,得出PMMo V、Chi VMV和PVMV是危害广东辣椒的优势病毒。同时发现,广东辣椒上多种病毒复合侵染现象普遍,在本研究125份病样中病毒复合侵染率达到88.0%,其中2种、3种、4种、5种、6种、7种和8种病毒复合侵染检出率分别为28.0%、25.6%、12.0%、9.6%、6.4%、1.6%和2.4%,由此可知,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。【结论】危害广东辣椒的病毒有14种,其中PMMo V、Chi VMV和PVMV为优势病毒,且复合侵染普遍,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。

关键词：辣椒病毒病种类鉴定小RNA深度测序 RT-PCR 广东省

黄瓜褐斑病(Corynespora cassiicola)在广东首次报道

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植物保护 2012年第5期38卷 197-200页

作者：蓝国兵谭耀华何自福罗方芳梁丽欢虞皓广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640 高要市农业技术推广中心广东526100

2011年5月和8月,在广东省高要市和增城市黄瓜主产区发现黄瓜褐斑病,致病性测定、形态学观察和rD-NA-ITS序列分析结果表明,引起广东黄瓜褐斑病的病原菌为多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)。本文是多主棒孢霉在广东引起黄瓜褐斑病的首... 详细信息

2011年5月和8月,在广东省高要市和增城市黄瓜主产区发现黄瓜褐斑病,致病性测定、形态学观察和rD-NA-ITS序列分析结果表明,引起广东黄瓜褐斑病的病原菌为多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)。本文是多主棒孢霉在广东引起黄瓜褐斑病的首次报道。

关键词：黄瓜褐斑病多主棒孢霉病原鉴定

广东省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析

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植物保护 2019年第4期45卷 143-148页

作者：汤亚飞佘小漫李正刚于琳蓝国兵邓铭光何自福广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

番茄黄化曲叶病毒病是世界番茄生产上一种毁灭性病害,番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)是引起该病害的主要病原病毒之一。本文采用滚环扩增及基因克隆方法,获得了侵染广东佛山和肇庆番茄的TYLCV 4个分离物全基因组... 详细信息

番茄黄化曲叶病毒病是世界番茄生产上一种毁灭性病害,番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)是引起该病害的主要病原病毒之一。本文采用滚环扩增及基因克隆方法,获得了侵染广东佛山和肇庆番茄的TYLCV 4个分离物全基因组;它们均为2 781 nt,编码6个ORF,其中病毒链上编码AV1和AV2,互补链上编码AC1、AC2、AC3和AC4。同源性比较结果表明,4个广东分离物基因组序列两两间同源性为99%以上;与已报道的TYLCV各分离物同源性在90%以上,而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源率均在98%以上。系统进化分析显示,广东分离物与来自中国不同地区的TYLCV分离物亲缘关系较近,并聚类在一个分支。因此,侵染引起广东佛山和肇庆番茄黄化曲叶病的病毒应来自国内其他地区。本研究是对TYLCV广东分离物分子特征的首次报道。

关键词：番茄黄化曲叶病毒分子鉴定序列分析