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棘突蛋白氨基端嵌入标签(记)蛋白的重组猪流行性腹泻病毒的拯救和鉴定

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微生物学通报 2024年第7期51卷 2534-2545页

作者：孙如晶董世娟于瑞嵩李震李春华司伏生谢春芳陈冰清张道敬华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海种猪工程技术研究中心上海201106 上海农业遗传育种重点实验室上海201106

【背景】猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是严重影响养猪业健康发展的动物传染病,其致病原为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。PEDV结构蛋白之一——棘突蛋白(spike protein,S protein)负责病毒的侵染、入胞等过程,该蛋白结构和功能研究是PEDV分子生物学研究的热点。S蛋白分为两个功能域,N端的S1亚单位和C端的S2亚单位,以往研究表明PEDV DR13att毒株S1N(19-233 aa)结构域缺失,不影响DR13att毒株的存活和增殖。【目的】基于靶向RNA重组技术,在PEDV(DR13att)S1N结构域分别引入HA标签基因、抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)基因,构建重组PEDV,考察S1N结构域能否被标签(记)蛋白或多肽替换。【方法】利用靶向RNA重组技术的PEDV反向遗传学操作平台,将转移载体p-PEDV-DR13att的S1N结构域(1-234 aa)分别替换成HA基因、APEX2基因,进行重组转移载体的构建,再分别将线性化的载体体外转录的RNA转染至m PEDV感染的LR7细胞,然后在Vero细胞上拯救重组PEDV。通过观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、RT-PCR检测、测序、间接免疫荧光分析(immunofluorescence assay,IFA)、Western blotting检测对重组病毒进行验证,最后测定重组病毒滴度并绘制重组病毒生长曲线,探究重组病毒与亲本病毒的生长特性。【结果】构建的重组病毒经过拯救和传代,发现引入HA标签蛋白的重组猪流行性腹泻病毒r PEDV-DR13-S1N-HA(r PEDV-DSH)在P1代出现细胞病变,引入APEX2蛋白的重组猪流行性腹泻病毒r PEDV-DR13-S1N-APEX2(rPEDV-DSA)盲传至P4代,未出现细胞病变。对P4代的rPEDV-DSH、rPEDV-DSA进行RT-PCR检测、测序、间接免疫荧光分析、蛋白质印迹法验证,证实引入HA标签的重组病毒r PEDV-DSH拯救成功,而携带APEX2的重组病毒未能拯救成功。重组病毒rPEDV-DSH生长曲线表明rPEDV-DSH与亲本毒株DR13att有相似的生长趋势,但病毒增殖水平显著低于亲本毒株。【结论】HA标签替换S1N(1-234 aa)结构域的重组PEDV rPEDV-DSH成功拯救,为进一步研究S蛋白与宿主细胞的互作机制建立了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 HA标签靶向RNA重组技术 S1N结构域

Infectivity of a genotype 4 hepatitis E virus cDNA clone by intrahepatic inoculation of laboratory rats

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猪流行性腹泻病毒诱导的猪肠道-乳腺-sigA轴以及免疫机制探讨

动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者： Yumin Zhu Xiaoming Yu Yuanshu Zhang Yanyan Ni fusheng si Ruisong Yu Shijuan Dong Yaowei Huang Zhen Li Institute of Animal Science and Veterinary Medicine Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding College of Veterinary Medicine Nanjing Agricultural University Center for Molecular Medicine and Infectious Diseases College of Veterinary Medicine Virginia Polytechnic Institute and State University

A cDNA clone of a genotype 4 swine hepatitis E virus (HEV) strain (SAAS-FX17), identified in Shanghai, has been constructed. Capped RNA transcripts were prepared in vitro and shown to be replication-competent in Huh7 cells. Sprague-Dawley (SD) rats administered the RNAtranscripts by intrahepatic inoculation developed active infections as evidenced by fecal virus shedding and sero-conversion to anti-HEV. The former was first detected between 23-30 days post-inoculation (dpi) and persisted until 45 dpi. Sera of rats inoculated with RNA transcripts became anti-HEV positive between 30 and 40 dpi, and reverted to anti-HEV negative at 52 dpi. Our data indicate for the first time that intrahepatic inoculation of rats with RNA transcripts of an HEV cDNAclone may serve as an alternative animal model for HEV research.

关键词： Hepatitis E virus (HEV) infectious clone genotype 4 rat animal model

来源： cnki会议评论

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微生物学通报 2021年第11期48卷 4240-4249页

作者：陈冰清葛艳司伏生董世娟李震上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海市农业遗传育种重点实验室上海市种猪育种工程中心上海201106 同济大学医学院上海200092

猪的"肠道-乳腺-sigA轴"免疫通路是指侵染猪的胃肠道病原通过胃肠道免疫可以激发乳腺产生sigA;sigA被初生仔猪摄取可以获得针对胃肠道病原的被动免疫保护。该免疫通路的反应动力模式涉及病原侵染、抗原提呈、淋巴细胞活化、淋巴细胞的... 详细信息

猪的"肠道-乳腺-sigA轴"免疫通路是指侵染猪的胃肠道病原通过胃肠道免疫可以激发乳腺产生sigA;sigA被初生仔猪摄取可以获得针对胃肠道病原的被动免疫保护。该免疫通路的反应动力模式涉及病原侵染、抗原提呈、淋巴细胞活化、淋巴细胞的肠道和乳腺归巢以及抗体分泌等诸多环节,受到病原毒力、母猪的妊娠阶段及免疫生理状态等众多因素影响。目前,猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)诱发的"肠道-乳腺-sigA轴"的理论可以解释自然感染状态下哺乳仔猪获得的被动免疫保护,但根据这一概念所设计的疫苗和免疫方案并未取得满意效果。本文综述了PEDV感染和宿主免疫各个环节的研究现状,分析了影响PEDV免疫和肠道-乳腺-s Ig A轴系反应的关键病原和宿主因素,提出了在轴系理论基础上应重视PEDV灭活疫苗以及特异IgG作用的建议。

关键词：肠道-乳腺-sigA轴猪流行性腹泻病毒动力模式 IgG IgA 细胞免疫体液免疫

Mechanical Behavior and Microstructure Evolution during Tensile Deformation of Twinning Induced Plasticity Steel Processed by Warm Forgings

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Journal of Wuhan University of Technology(Materials Science) 2024年第2期39卷 417-424页

作者：王文 ZHAO Modi WANG Xingfu 汪聃韩福生 School of Aerospace and Mechanical Engineering Flight College Changzhou Institute of TechnologyChangzhou 213032China Key Laboratory of Materials Physics Institute of Solid State PhysicsChinese Academy of SciencesHefei 230031China School of Physics and Electronic Information Yan’an UniversityYan’an 716000China

The mechanical behavior and microstructural evolution of an Fe-30Mn-3Al-3si twinninginduced plasticity(TWIP)steel processed using warm forging was *** is found that steel processed via warm forging improves comprehensive mechanical properties compared to the TWIP steel processed via cold rolling,with a high tensile strength(R_(m))of 793 MPa,a yield strength(R_(P))of 682 MPa,an extremely large R_(P)/R_(m)ratio as high as 0.86 as well as an excellent elongation rate of 46.8%.The microstructure observation demonstrates that steel processed by warm forging consists of large and elongated grains together with fine,equiaxed *** micro-defect configurations were also observed within the steel,including dense dislocation networks and a few coarse deformation *** the plastic deformation proceeds,the densities of dislocations and deformation twins significantly ***,a great number of slip lines could be observed in the elongated *** findings reveal that a much more dramatic interaction between microstructural defect and dislocations glide takes place in the forging sample,wherein the fine and equiaxed grains propagated dislocations more rapidly,together with initial defect configurations,are responsible for enhanced strength ***,larger,elongated grains with more prevalently activated deformation twins result in high plasticity.

关键词： TWIP steel twinning mechanical property deformation mechanism microstructure

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猪流行性腹泻病毒免疫及疫苗研制

生物工程学报 2021年第8期37卷 2603-2613页

作者：董世娟谢春芳司伏生陈冰清于瑞嵩李震上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海市农业遗传育种重点实验室上海201106 上海市种猪育种工程中心上海201106

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是严重危害我国和世界养猪业的重要动物疫病,其致病原为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),属冠状病毒科α冠状病毒属。文中综述分为5个部分。前两部分在介绍该病病... 详细信息

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是严重危害我国和世界养猪业的重要动物疫病,其致病原为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),属冠状病毒科α冠状病毒属。文中综述分为5个部分。前两部分在介绍该病病原及其流行病学的基础上先概括了初生仔猪的被动免疫途径和初乳的重要功效。第三部分总结了母猪孕期免疫的特点,讨论了"肠道-乳腺-sigA轴"理论及其可能的作用机理,提出了一系列PEDV免疫防控中应重点关注的理论技术问题。最后两部分分别总结了PEDV疫苗的研发现状并对PEDV免疫防控的未来发展作了展望。

关键词：猪流行性腹泻病毒冠状病毒疫苗免疫肠道-乳腺-sigA轴

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澜沧江扎泥沟泥石流特征研究

西北水电 2017年第6期 27-30页

作者：胡华王蕾司富生中国电建集团西北勘测设计研究院有限公司西安710065

通过对澜沧江流域扎泥沟典型泥石流冲沟的地质环境、沟谷特征以及泥石流活动特征的论述,较全面地反映了扎泥沟泥石流物质组成和动力学特征,为地质环境相似的泥石流灾害研究和防治提供了一个典型实例和依据。

关键词：扎泥沟泥石流沟谷特征活动特征

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深厚砂砾石颗粒分布不均一性研究探讨

西北水电 2017年第4期 57-62页

作者：司富生黄民奇张晖中国电建集团西北勘测设计研究院有限公司西安710065

砂砾石"颗粒分布的不均一性",目前行业并无统一定义和标准评价,也未出现在相关规范术语中。拟建的茨哈峡水电站工程中,因拟采用的砂砾石料分布广、埋深大、厚度大,而且电站工程属超高坝,砂砾石用于填筑250~300 m级高坝尚无经验。文章探... 详细信息

砂砾石"颗粒分布的不均一性",目前行业并无统一定义和标准评价,也未出现在相关规范术语中。拟建的茨哈峡水电站工程中,因拟采用的砂砾石料分布广、埋深大、厚度大,而且电站工程属超高坝,砂砾石用于填筑250~300 m级高坝尚无经验。文章探讨了深厚砂砾石颗粒分布不均一性问题的研究思路、方法。希望对同类专题研究有一定的借鉴作用。

关键词：砂砾石料不均一性筛分茨哈峡水电站

猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白40-91 aa是其细胞质定位的关键结构域

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生物工程学报 2020年第6期36卷 1113-1125页

作者：陈冰清沈媚司伏生董世娟于瑞嵩谢春芳李震上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海市农业遗传育种重点实验室上海201106 上海种猪工程技术研究中心上海201106 上海海洋大学水产与生命学院上海201106

ORF3蛋白是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)基因组编码的唯一的辅助蛋白,与病毒毒力相关。为确定PEDV ORF3细胞质定位信号,文中构建了系列PEDV DR13wt ORF3蛋白全长或截短肽重组表达载体,转染Vero细胞并利用激... 详细信息

ORF3蛋白是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)基因组编码的唯一的辅助蛋白,与病毒毒力相关。为确定PEDV ORF3细胞质定位信号,文中构建了系列PEDV DR13wt ORF3蛋白全长或截短肽重组表达载体,转染Vero细胞并利用激光共聚焦显微镜分析与EGFP融合表达的全长ORF3蛋白和其系列截短肽在细胞内的分布。结果表明,全长ORF3蛋白或所有包含2个跨膜域的40–91 aa基序的ORF3截短肽均只定位于细胞质中,而不包含40–91aa基序的ORF3截短肽分布于整个细胞中(细胞质和细胞核均有分布)。这表明40–91 aa是猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白细胞质定位的关键结构域。PEDVORF3蛋白细胞质定位结构域的明确为进一步研究其细胞内转运和生物学功能提供了参考。

关键词：猪流行性腹泻病毒 ORF3蛋白细胞质定位定位信号跨膜域

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附属蛋白:冠状病毒不容忽视的一类蛋白

微生物学通报 2021年第10期48卷 3895-3909页

作者：司伏生姜黎于瑞嵩董世娟谢春芳陈冰清李震上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106 上海市农业遗传育种重点实验室上海201106 中国科学院华南植物园广东广州510650

冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)是基因组最大的一类单股正链RNA病毒,多数可以跨物种传播并感染人类,是当前引起重大公共卫生事件、严重威胁人类健康的病原之一。病毒基因组全长约25-31 kb,编码多个非结构蛋白、结构蛋白(S、E、M、N)及附... 详细信息

冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)是基因组最大的一类单股正链RNA病毒,多数可以跨物种传播并感染人类,是当前引起重大公共卫生事件、严重威胁人类健康的病原之一。病毒基因组全长约25-31 kb,编码多个非结构蛋白、结构蛋白(S、E、M、N)及附属蛋白。对于大多数冠状病毒来说,附属蛋白虽然是病毒复制的非必需蛋白,但往往在病毒的致病过程中发挥重要作用,是冠状病毒重要的功能蛋白。该类蛋白位于病毒基因组的3′端,由位于基因起始位置的转录调控序列(Transcription Regulating Sequence,TRS)调控其m RNA的转录,而且蛋白编码序列的密码子使用偏爱性对蛋白翻译也产生重要影响。附属蛋白具有跨膜蛋白的属性和独特的蛋白转运基序,后者对该类蛋白跨膜区的形成、拓扑学结构及蛋白的细胞内运输过程起决定性的作用,从而直接影响附属蛋白的功能。本文首先总结了冠状病毒最新的分类及基因组结构;然后从附属蛋白的种类、功能、蛋白转运基序、拓扑学结构及密码子使用偏爱性等方面系统概述了相关研究进展,并对下一步的研究方向进行了展望,为更加全面地认识冠状病毒附属蛋白的生物学特性提供重要参考。

关键词：冠状病毒附属蛋白细胞内转运拓扑学密码子使用偏爱性