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光皮桦MYB基因的克隆及表达和调控分析

林业科学 2018年第12期54卷 70-81页

作者：倪飞励文豪林二培童再康黄华宏浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室杭州311300

【目的】MYB转录因子是植物中一类重要的转录因子,在调控次生壁纤维素和木质素等的合成中具有重要作用。为了挖掘参与光皮桦木材形成的MYB基因,本研究通过克隆MYB基因,分析其序列特征、表达模式和下游调控基因,以期为后续功能深入解析... 详细信息

【目的】MYB转录因子是植物中一类重要的转录因子,在调控次生壁纤维素和木质素等的合成中具有重要作用。为了挖掘参与光皮桦木材形成的MYB基因,本研究通过克隆MYB基因,分析其序列特征、表达模式和下游调控基因,以期为后续功能深入解析和分子辅助育种提供理论依据和基因资源。【方法】利用RACE技术分离到4个光皮桦BlMYB基因的cDNA片段。利用生物信息学工具对这些基因的序列特征进行分析,利用实时荧光定量PCR分析BlMYB及预测的下游基因在不同器官(雌花序、雄花序、嫩芽、嫩叶、成熟叶、茎)、组织(内外层木质部、韧皮部、形成层)中,以及应拉木诱导早期阶段的表达差异。以2个木质部特异表达的BlMYB为指导基因,采用相互排名法和Cytoscape软件构建共表达网;使用Plant CARE在线查询共表达的下游基因启动子区元件。【结果】分离到4个BlMYB的全长cDNA序列,分别命名为BlMYB1、BlMYB2、BlMYB3和BlMYB4,它们编码的蛋白分别由395、252、258、320个氨基酸残基组成,且在靠近N端都有R2R3结构域。4个BlMYB氨基酸序列间一致性27%～37%,而与它们同源的拟南芥AtMYB氨基酸序列间的一致性为39%～55%。4个BlMYB基因都含有1～2个内含子。进化树构建分析发现4个BlMYB分属于4个不同的分支,其中BlMYB2、BlMYB4分别与细胞次生壁形成相关的MYB聚在一起。BlMYB1、BlMYB3在成熟叶片中优势表达,且随叶片成熟表达水平呈递增趋势,可能与叶片的发育有关。BlMYB2在木质化茎段的木质部强烈表达,而在叶片、韧皮部等组织中的表达相对较弱;在应拉木诱导形成的早期阶段,应拉木中BlMYB2呈下调表达,尤其是拉弯处理48 h和7天时的相应数值均显著低于直立木。BlMYB4在茎的木质部、成熟雄花序中优势表达,在根、嫩叶中的表达水平较低;同时,在应拉木诱导形成早期阶段,BlMYB4在应拉木和对应木中分别呈现上调和下调表达。另外,基于共表达分析和特异性AC元件筛选,推测FRK、COMT、HCT、CesA3、CesA4、4CL、CCoAOMT 7个纤维素、木质素合成酶基因可能受BlMYB2和BlMYB4所调控。【结论】获得的4个光皮桦BlMYB基因属于R2R3-MYB家族,具不同的基因结构。4个基因呈现不同的表达模式暗示它们可能参与调控不同代谢途径。结合光皮桦应拉木特征和共表达分析结果,可初步推测BlMYB2和BlMYB4可能参与光皮桦木材形成过程的调控。

关键词：光皮桦 BlMYB基因应拉木表达模式共表达

光皮桦果胶甲酯酶家族的鉴定与生物信息学分析

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分子植物育种 2023年第21期21卷 6961-6971页

作者：周凯汤定钦林二培浙江农林大学林业与生物技术学院杭州311300

果胶甲酯酶(pectin methylesterase, PME)是调节果胶甲酯化程度的酶,通过作用于细胞壁在植物的各个生长阶段和生理过程中发挥重要作用。目前在模式植物拟南芥中对PME研究较多,而在木本植物中研究较少。光皮桦(Betula luminifera)是中国... 详细信息

果胶甲酯酶(pectin methylesterase, PME)是调节果胶甲酯化程度的酶,通过作用于细胞壁在植物的各个生长阶段和生理过程中发挥重要作用。目前在模式植物拟南芥中对PME研究较多,而在木本植物中研究较少。光皮桦(Betula luminifera)是中国重要用材树种,研究光皮桦PME基因家族可助于了解光皮桦木材形成机制及逆境响应机制。为研究光皮桦PME基因家族的功能,利用生物信息学方法对光皮桦基因组中PME基因家族成员进行鉴定,并对其基因组信息、蛋白生理生化特征、系统进化树、保守基序和基因表达等方面进行了研究。结果表明,在光皮桦中共鉴定88个PME蛋白序列,包括37个Type-1 PME和51个Type-2PME;预测光皮桦PME蛋白大部分为稳定的碱性亲水蛋白;光皮桦PME基因家族与毛果杨和拟南芥在聚类结果一致;光皮桦PME序列中有10个比较保守的基序,其中motif 10是Type-1 PME特有的;大多数PME基因在各组织中都有表达,尤其在雄花序中突出表达,不同Group表达情况有一定的规律性。本研究为进一步研究PME基因家族在光皮桦中的功能奠定了基础。

关键词：光皮桦(Betula luminifera) 果胶甲酯酶基因鉴定生物信息学分析

光皮桦应拉木的显微特征及其形成早期内源激素分布

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林业科学 2016年第10期52卷 38-44页

作者：何辉楼雄珍林二培俞友明童再康黄华宏浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地临安311300

【目的】分析光皮桦应拉木的显微结构、理化特性及其形成早期的内源激素分布,以期为揭示应拉木形成机制提供理论依据。【方法】以无性系1V25-2为材料,通过人工拉弯诱导形成应拉木,测定其主要显微特征和物理化学特性,并应用ELISA分析其... 详细信息

【目的】分析光皮桦应拉木的显微结构、理化特性及其形成早期的内源激素分布,以期为揭示应拉木形成机制提供理论依据。【方法】以无性系1V25-2为材料,通过人工拉弯诱导形成应拉木,测定其主要显微特征和物理化学特性,并应用ELISA分析其形成早期阶段主要内源激素的分布规律。【结果】经12个月的拉弯处理,应拉区木质部的细胞壁明显增厚,纤维平均双壁厚是对应木的1.8倍,形成明显的胶质纤维层。应拉木的平均纤维长度、纤维素含量均明显大于对应木,而木质素含量则相反。拉弯处理的早期阶段,不同木质部类型中的4种激素含量呈现不同的分布特征。应拉区木质部中IAA含量均小于对应区,但仅处理7天的木质部样品两区块间差异达到显著水平。GAs(GA1+GA3)也表现出与IAA类似的变化规律。除拉弯处理6 h的样品外,应拉区木质部BR含量均显著小于对应区和对照,且随着处理时间延长对应区木质部BR含量呈递增趋势。ZR含量在应拉区和对应区木质部间皆无明显差异,但表现出随处理时间延长而增加的趋势,处理7天时2区块的ZR含量均显著高于对照。【结论】经12个月的拉弯处理,光皮桦应拉区木质部的细胞壁明显增厚,出现明显的胶质纤维层;平均纤维长度、纤维素含量增加,表现出特有的理化特征。在拉弯处理早期阶段,4种内源激素在木质部中的含量呈现出不同的分布变化,推测这些激素的重新分布可能与光皮桦应拉木的形成有一定关系。

关键词：光皮桦应拉木显微特征理化特性内源激素分布规律

光皮桦BlBLH1基因的克隆、表达及互作蛋白筛选

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林业科学 2022年第3期58卷 59-68页

作者：庄和必俞子承林二培黄华宏浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室杭州311300

【目的】BLH基因家族是广泛存在于植物中的转录因子,其与KNOX等转录因子的互作被认为在植物的次生壁发育中起重要调控作用。本研究拟克隆光皮桦BlBLH1基因,分析其表达模式,并筛选能与其互作的蛋白。【方法】利用Blast等软件在光皮桦基... 详细信息

【目的】BLH基因家族是广泛存在于植物中的转录因子,其与KNOX等转录因子的互作被认为在植物的次生壁发育中起重要调控作用。本研究拟克隆光皮桦BlBLH1基因,分析其表达模式,并筛选能与其互作的蛋白。【方法】利用Blast等软件在光皮桦基因组序列中鉴定获得BlBLH1序列,克隆验证后对其进行多序列比对、系统进化等生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析BlBLH1在光皮桦不同组织、器官和应拉木形成中的表达模式;通过酵母双杂交技术筛选BlBLH1互作的蛋白,并采用双分子荧光互补实验(BiFC)进一步验证其与部分蛋白在拟南芥细胞内的互作。【结果】BlBLH1基因序列全长为2128 bp,开放阅读框(ORF)为1830 bp,编码609个氨基酸,具有SKY、BEL和HD 3个保守结构域。系统进化分析显示,BlBLH1与拟南芥BLH1有最近的同源关系。表达分析显示BlBLH1在雄花序中的表达量最高;在木质化茎段中的表达量次之;在应拉木诱导过程中,BlBLH1在应拉木中的表达量均显著高于对照。通过酵母双杂交筛选获得结构蛋白、酶、转录因子等47个与BlBLH1互作较强的蛋白;BiFC验证结果表明,BlBLH1与BlKNOX4、BlKNOX9在拟南芥原生质体内存在互作关系。而且,三者在茎段和应拉木的表达趋势基本一致。【结论】可从光皮桦中分离获得BlBLH1基因,生物信息学、表达和蛋白互作分析的结果表明BlBLH1参与光皮桦木材形成过程,且存在与KNOX蛋白的互作关系。

关键词： BlBLH1 次生壁酵母双杂交双分子荧光互补

杉木叶片原生质体分离及RNA提取体系的建立

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林业科学 2018年第4期54卷 38-48页

作者：唐佳妮林二培黄华宏童再康楼雄珍浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室杭州311300

【目的】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分析不同因素对杉木原生质体分离的影响,建立杉木叶片原生质体分离体系,以期为杉木基因功能验证提供有效的技术平台;比较不同RNA提取方法,筛选获得杉木原生质体总RNA提取的有效方法,为今后利用杉木... 详细信息

【目的】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分析不同因素对杉木原生质体分离的影响,建立杉木叶片原生质体分离体系,以期为杉木基因功能验证提供有效的技术平台;比较不同RNA提取方法,筛选获得杉木原生质体总RNA提取的有效方法,为今后利用杉木原生质体开展分子生物学研究提供技术支持,也可为其他林木原生质体的总RNA提取研究提供参考。【方法】选取杉木组培苗最上端未分轮的幼嫩叶片为材料,通过分析5种不同酶组合、真空处理时间(0、5、10、15、20 min)、渗透压(0.3、0.4、0.5、0.6 mol·L-1甘露醇)、BSA浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)及酶解时间(1、2、3、4、5 h)5个条件,进行杉木叶片原生质体的分离。采用改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、CTAB-Li Cl法、CTAB-Li Cl+10μg糖原法、改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法、天根RNA提取试剂盒法共7种方法提取杉木原生质体RNA,通过杉木内参基因和2个特异基因进行RNA质量验证,比较不同方法的提取效果。【结果】在1.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.2%果胶酶Y-23、0.5 mol·L-1甘露醇以及0.3%BSA的混合酶液中,真空处理10 min,酶解2 h,可分离出高活力的纯净杉木原生质体,其产量可达到7.27×106个·g-1,活力可达到94%。7种方法皆能提取出杉木叶片原生质体的总RNA,但不同方法间存在明显差异,其中改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、改良CTAB-Li Cl法、改良CTAB-Li Cl+10μg糖原法提取的RNA有不同程度的降解现象,其余方法所提取的RNA完整性较好,且OD260/280和OD260/230值均在1.8~2.0范围内;在RNA得率方面,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg,分别是改良CTAB-异丙醇法和天根RNA提取试剂盒法的1.73倍和1.58倍;综合考虑,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法提取杉木原生质体RNA的效果最好。【结论】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分离条件为纤维素酶R-10浓度1.5%、离析酶R-10浓度1%、果胶酶Y-23浓度0.2%、甘露醇浓度0.5 mol·L-1、BSA浓度0.3%,真空处理10 min,酶解2 h,可大量获得高质量的杉木原生质体;利用改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法,可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg。研究结果为杉木重要性状关键基因的功能研究及其在育种中的应用提供了重要基础。

关键词：杉木原生质体 RNA CTAB法糖原

杉木与台湾杉EST-SSR标记的开发与应用

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林业科学 2013年第10期49卷 173-180页

作者：张圣黄华宏林二培童再康浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地临安311300

简单序列重复（Simple Sequence Repeats,SSR）标记是基于SSR中核苷酸单位串联重复次数不同而开发的一种分子标记技术,具有多态性丰富、呈共显性遗传、易于PCR检测,在基因组上分布均匀等特点（Powell et al.,1996）。直接利用现有的EST... 详细信息

简单序列重复（Simple Sequence Repeats,SSR）标记是基于SSR中核苷酸单位串联重复次数不同而开发的一种分子标记技术,具有多态性丰富、呈共显性遗传、易于PCR检测,在基因组上分布均匀等特点（Powell et al.,1996）。直接利用现有的EST（Expressed Sequence Tag）序列开发SSR标记就是目前采用较多的一种策略。

关键词：杉木台湾杉 EST SSR 遗传多样性

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云锦杜鹃转录组分析

浙江农林大学学报 2019年第6期36卷 1190-1198页

作者：许蔷薇楼雄珍杨彬林二培童再康浙江农林大学林业与生物技术学院浙江杭州311300 浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室浙江杭州311300

云锦杜鹃Rhododendron fortunei具有很高的园艺观赏价值。由于缺乏相关的遗传信息,云锦杜鹃的多样性、分子辅助育种等工作进展较为缓慢。通过高通量测序技术(Illumina),对云锦杜鹃的转录组进行了测定和分析。通过测序拼接和去冗余共获得... 详细信息

云锦杜鹃Rhododendron fortunei具有很高的园艺观赏价值。由于缺乏相关的遗传信息,云锦杜鹃的多样性、分子辅助育种等工作进展较为缓慢。通过高通量测序技术(Illumina),对云锦杜鹃的转录组进行了测定和分析。通过测序拼接和去冗余共获得84 633条单基因簇(unigene)序列,平均长度为691.4 bp。通过与公共数据库比对成功注释到了35 526条单基因簇,其中与葡萄Vitis vinifera基因相似的序列最多。根据基因本体论数据库(GO)可将23 215个单基因簇归类于生物学过程、细胞组分及分子功能等三大类的55个功能组;真核直系同源基因数据库(KOG)将11 085条单基因簇分为26个功能分类,涉及一般功能预测的单基因簇最多,多达1 970条;以京都基因与基金组百科全书(KEGG)作为参考,依据代谢途径可将9 887个单基因簇定位到272个代谢通路。进一步分析基因注释结果,挖掘获得24个编码MADS-box基因的单基因簇分属于10个不同亚家族。此外,检测到了21 900个简单序列重复(SSR)位点,可用于SSR标记开发。

关键词：林木育种学云锦杜鹃转录组基因注释简单序列重复(SSR)

杉木应压木形成中的显微特征及主要代谢成分变化

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核农学报 2022年第11期36卷 2307-2315页

作者：杜明秋钟珊丽林二培黄华宏浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室浙江杭州311300

为了解析主要代谢成分与杉木(Cunninghamia lanceolata)应压木形成的关系,以3年生直立杉木苗为研究对象,与垂直方向倾斜45°放置30、60和90 d后观察其生长性状并测定木质纤维素含量,使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对木质部代谢成分进... 详细信息

为了解析主要代谢成分与杉木(Cunninghamia lanceolata)应压木形成的关系,以3年生直立杉木苗为研究对象,与垂直方向倾斜45°放置30、60和90 d后观察其生长性状并测定木质纤维素含量,使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对木质部代谢成分进行鉴定和解析。解剖发现应压木木质部管胞发生变形;化学成分测定发现总木质素和半纤维素含量增加,纤维素含量降低;GC-MS检测出应压木、对应木和直立木中共有成分20种,其中有机酸7种、单糖3种、二糖2种、醇类3种、氨基酸2种、酚类和糖苷类各1种;主成分分析结合显著性检验发现,3个时期应压木和直立木中有11种共有差异代谢物,其中乙醇酸、甘氨酸、核糖酸和棕榈酸在应压木中的含量显著低于对应木和直立木,苹果酸、松醇、肌醇、半乳糖和蔗糖在应压木中的含量显著高于对应木和直立木。本试验结果从代谢角度解释了杉木应压木形成中的生物学变化,可为揭示木材形成的分子机制提供新途径,并为高品质木材的定向培育和木材功能性改良提供理论依据。

关键词：应压木杉木有机酸类糖类气相色谱-质谱法(GC-MS)

杉木苯丙氨酸解氨酶基因ClPAL的克隆与表达分析

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林业科学 2013年第12期49卷 64-72页

作者：徐莉莉童再康林二培黄华宏浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地临安311300

利用RACE方法从杉木中分离得到3个编码苯丙氨酸解氨酶(PAL)的全长cDNA序列,分别为2 455,2 418,2 689 bp,编码的氨基酸个数分别为709,710,709。氨基酸序列分析显示,推导的氨基酸序列包含PAL-HAL和PAL 2个功能域以及酶活性中心序列(GTITAS... 详细信息

利用RACE方法从杉木中分离得到3个编码苯丙氨酸解氨酶(PAL)的全长cDNA序列,分别为2 455,2 418,2 689 bp,编码的氨基酸个数分别为709,710,709。氨基酸序列分析显示,推导的氨基酸序列包含PAL-HAL和PAL 2个功能域以及酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA)。荧光定量PCR分析表明,虽然3个ClPAL基因在调查的器官和组织中皆有表达,但仍表现出一定的组织特异性。ClPAL1在木质化茎中的表达量明显高于针叶、雌球花、根和非木质化茎中的表达量,ClPAL3主要在木质化茎中表达;二者均在木质部中优势表达,且在中间材中的表达量高出边材20倍以上。ClPAL2主要在富含韧皮部针叶和皮层中高丰度表达。IAA、GA3和BR能促进木质部细胞的分化,与木质素的生物合成有直接或间接的联系。经此3种激素处理后,ClPAL1和ClPAL3的表达模式相似,均受到不同程度的诱导,其中IAA和BR的诱导效应相对明显;ClPAL2基因的表达则受到相对弱的抑制。这些结果说明ClPAL1和ClPAL3可能主要参与了杉木木材中木质素的合成过程。在应压木诱导形成中,ClPAL1在应压区木质部的表达量表现为先下降后上升,处理10天后达对照的1.4倍,在对应区木质部中则呈现下调表达;ClPAL2在应压区木质部中表现为上调表达,而在对应区木质部中,仅处理10天后的表达量明显高于对照;ClPAL3的表达量变化不是很明显。另外,ClPAL2基因在中间材中的表达丰度也明显高于边材,是否参与杉木心材特殊色泽的形成值得深入研究。

关键词：杉木 PAL基因基因克隆基因表达木材形成