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Acta Pharmaceutica Sinica B 2016年第2期6卷 148-157页

作者： Tao Li Shuaixing Zhuang Yiwei wang Yanli wang Weihao wang Huihui Zhang Li Chen dunfang wang Zhongming Zhou Weipeng Yang Institute of Chinese Materia Medica China Academy of Chinese Medical Sciences Experimental Research Center China Academy of Chinese Medical Sciences China Food and Drug Administration

The quality control processes for herbal medicines have been problematic. Flavonoids are the major active components of Huangqin Tang(HQT, a traditional Chinese medicine formula). In this study, we used a combinative method approach consisting of chromatographic fingerprinting(high performance liquid chromatography; HPLC), quantitative methods and a pharmacodynamic evaluation model to analyze the flavonoids of HQT obtained from different sources. Ten batches of HQT were analyzed by the HPLC fingerprinting method and 26 common peaks were detected, of which 23 peaks corresponded with the chemical profile of HQT. In addition, 11 major compounds were identified by LC–MS analysis(liquid chromatography–tandem mass spectrometer; LC–MS^n) and quantified by the HPLC quantitative method approach. The studied10 batches of HQT were found to be homogeneous in their composition with a similarity between 0.990 and1.000. The distribution of the 11 identified compounds was found to be very similar among the batches. Only slight pharmacodynamic differences were detected between the different batches, confirming the homogeneity of HQT. The results of this study prove that the combination of chromatographic fingerprinting and quantitative analysis can be readily used for comprehensive quality control of herbal medicines.

关键词： Radix Scutellariae Flavonoids HPLC fingerprinting analysis Multiple-component quantitative analysis Paw edema Carrageenin Antipyretic Anti-inflammatory

Mechanism of Sishen Pills-Tongxie Yaofang in the treatment of ulcerative colitis based on network pharmacology and experimental verification

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Science of Traditional Chinese Medicine 2024年第3期2卷 224-236页

作者： Haifan Liu Xue Feng dunfang wang Li Liu Yaqing Liu Bin Liu Lin Zhu Caijuan Zhang Weipeng Yang Institute of Chinese Materia Medica China Academy of Chinese Medical SciencesBeijingChina Heilongjiang University of Chinese Medicine HarbinChina

Background:Ulcerative colitis(UC)is a diffuse nonspecific intestinal ***-kidney Yang deficiency combined with liver stagnation is the most common *** Pills-Tongxie Yaofang(SSP-TXYF)is a traditional Chinese medicine(TCM)that is widely used in the treatment of this ***,its pharmacological mechanism and active components remain ***:This study elucidated the potential mechanism and active components of SSP-TXYF in the treatment of UC from the perspective of TCM ***:Metascape,STRING,and Cytoscape were used to explore the SSP-TXYF-compound-target-UC network and biological enrichment pathways,so as to screen the active compounds,key targets,and pathways of *** the construction of a rat model with UC,the key targets and active components were verified after SSP-TXYF ***:A total of 77 effective active chemical components,208 potential targets,and 5 core target genes were screened *** Ontology biological process items and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes signaling pathways showed that SSP-TXYF played a role in regulating nerve-endocrine,cell proliferation and apoptosis,and immune-related *** main compounds and the target protein exhibited a good binding ability in molecular *** results of animal experiments showed that SSP-TXYF could improve UC through IL-6,AKT1,PTGS2,CASP3,and JUN,and nobiletin and wogonin were identified as the main active ***:This study suggests that nobiletin and wogonin are the main components of SSP-TXYF in the treatment of UC,which provides effective therapeutic targets and drugs for future clinical treatment of UC.

关键词： Sishen Pills-Tongxie Yaofang(SSP-TXYF) Ulcerative colitis Network pharmacology Active components Mechanism

黄芩汤对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞的抗炎作用

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中国实验方剂学杂志 2023年第7期29卷 20-28页

作者：刘雅清刘滨马旭冉王敦方冯雪杨伟鹏中国中医科学院中药研究所北京100700 黑龙江中医药大学哈尔滨150040

目的:以RAW264.7细胞为炎症模型,探究黄芩汤的抗炎作用机制。方法:制备黄芩汤,筛选对RAW264.7细胞的安全剂量;将RAW264.7细胞接种于24孔板中,先后加入黄芩汤和脂多糖(LPS),分别采用Griess法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定一氧化氮(NO... 详细信息

目的:以RAW264.7细胞为炎症模型,探究黄芩汤的抗炎作用机制。方法:制备黄芩汤,筛选对RAW264.7细胞的安全剂量;将RAW264.7细胞接种于24孔板中,先后加入黄芩汤和脂多糖(LPS),分别采用Griess法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定一氧化氮(NO)和白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素E_(2)(PGE_(2))的含量;将RAW264.7细胞接种于6孔板中,设空白组、LPS组、LPS+黄芩汤组、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)抑制剂(PDTC)组、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)抑制剂(SB203580)组、细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂(PD98059)组、c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂(SP600125)组、Janus酪氨酸蛋白激酶(JAK)抑制剂(AG490)组,先后加入相应的抑制剂和黄芩汤,并经LPS刺激后,提取RNA和蛋白,分别采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测NF-κB p65、p38MAPK、ERK、JNK和JAK mRNA及蛋白的表达水平,探究黄芩汤通过调控NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和JAK/信号转导及转录激活因子(STAT)信号通路发挥抗炎作用的机制。结果:与空白组比较,LPS刺激后,模型组细胞中NO、IL-6、TNF-α、PGE_(2)的浓度明显增加(P<0.05,P<0.01),与模型组比较,加入黄芩汤后,NO、IL-6、TNF-α、PGE_(2)分泌量有减少趋势(P<0.05,P<0.01);与空白组比较,模型组细胞内p38 MAPK、ERK、JNK、JAK和NF-κB p65 mRNA及总蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01),与模型组比较,黄芩汤孵育后,炎症细胞内p38 MAPK、ERK、JNK、JAK和NF-κB p65总蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.05,P<0.01);同时各抑制剂组细胞内NF-κB p65总蛋白及mRNA表达均有下降趋势(P<0.05,P<0.01)。结论:黄芩汤能够通过NF-κB、MAPK和JAK/STAT信号通路抑制炎症反应。

关键词：黄芩汤炎症核转录因子-κB(NF-κB)信号通路丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路 Janus酪氨酸蛋白激酶(JAK)/信号转导及转录激活因子(STAT)信号通路

黄芩汤治疗溃疡性结肠炎及相关结肠癌的机制研究进展

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中国实验方剂学杂志 2023年第7期29卷 1-10页

作者：冯雪刘雅清刘滨马旭冉王敦方杨伟鹏中国中医科学院中药研究所北京100700 黑龙江中医药大学哈尔滨150040

溃疡性结肠炎是一种病因尚不明确的慢性肠道疾病,主要症状为腹痛、腹泻、黏液脓血便等,并可伴有多种并发症,转化为结肠癌的风险较高。近年来溃疡性结肠炎和相关结肠癌的发病率有上升的趋势,严重影响人体健康和生活质量。手术和免疫抑制... 详细信息

溃疡性结肠炎是一种病因尚不明确的慢性肠道疾病,主要症状为腹痛、腹泻、黏液脓血便等,并可伴有多种并发症,转化为结肠癌的风险较高。近年来溃疡性结肠炎和相关结肠癌的发病率有上升的趋势,严重影响人体健康和生活质量。手术和免疫抑制剂等是现代临床治疗溃疡性结肠炎和相关结肠癌的主要方法,但这些方法均有不同的不良反应,治疗效果不理想。多年来,中医药由于其不良反应小,疗效显著,在治疗溃疡性结肠炎和相关结肠癌方面备受关注。黄芩汤出自《伤寒论》,由黄芩、芍药、甘草和大枣组成,具有清热止利、和中止痛之功效,用于治疗溃疡性结肠炎疗效显著。黄芩汤成分复杂,以多靶点多途径发挥作用。经文献查阅并结合本课题组多年的研究成果,发现黄芩汤治疗溃疡性结肠炎和相关结肠癌的作用机制可能与保护肠黏膜屏障,抑制炎症反应,促进线粒体自噬,抑制氧化应激,调控肠道菌群、细胞周期、基因表达,抑制细胞增殖和促进细胞凋亡等多种机制相关。现将近年来的研究情况进行较为详尽的综述,以期能够为黄芩汤作用机制的深入研究及临床用药提供理论参考。

关键词：溃疡性结肠炎结肠癌黄芩汤机制

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黄芩汤通过Nrf2信号通路对Caco-2细胞抗氧化应激作用的机制

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中国实验方剂学杂志 2023年第7期29卷 29-37页

作者：冯雪刘雅清刘滨马旭冉王敦方杨伟鹏中国中医科学院中药研究所北京100700 黑龙江中医药大学哈尔滨150040

目的:以Caco-2细胞为载体,结合基因干扰(RNAi)技术,通过体外实验进一步验证黄芩汤基于核因子E2相关因子2(Nrf2)通路发挥的抗氧化应激作用。方法:将处于对数生长期的Caco-2细胞,经siRNA转染,构建siRNA Caco-2细胞;将正常Caco-2细胞和siRN... 详细信息

目的:以Caco-2细胞为载体,结合基因干扰(RNAi)技术,通过体外实验进一步验证黄芩汤基于核因子E2相关因子2(Nrf2)通路发挥的抗氧化应激作用。方法:将处于对数生长期的Caco-2细胞,经siRNA转染,构建siRNA Caco-2细胞;将正常Caco-2细胞和siRNA Caco-2细胞与不同浓度的黄芩汤共同孵育后,提取RNA和蛋白,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)技术检测血红素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、接头蛋白Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)及Nrf2 mRNA和蛋白的表达;同时,采用比色法和探针法检测各组细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力及丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的表达水平。结果:与空白组比较,仅有黄芩汤400 mg·L^(-1)组与萝卜硫素(SFN)组可降低正常Caco-2细胞内ROS、MDA含量(P<0.01);而黄芩汤各剂量组与SFN组细胞内SOD与GSH-Px活力均有增加的趋势,且黄芩汤400 mg·L^(-1)组和SFN组与空白组比较差异有显著统计学意义(P<0.01);同时,各组细胞HO-1、GST、Keap1、NQO1和Nrf2蛋白及mRNA的表达量均有明显升高的趋势(P<0.05,P<0.01)。经转染后,与空白组比较,模型组细胞内MDA和ROS的含量升高,而GSH-Px和SOD的活力及HO-1、GST、Keap1和NQO1蛋白及mRNA的表达量均有不同程度地降低(P<0.05,P<0.01),与药物孵育后,与模型组比较,SFN组细胞内SOD活力和SFN组、黄芩汤各给药组GSH-Px活力显著升高(P<0.01),黄芩汤400 mg·L^(-1)组、200 mg·L^(-1)组和SFN组细胞内SOD和GSH-Px活力均有升高的趋势(P<0.01),黄芩汤400 mg·L^(-1)组和SFN组MDA有降低的趋势,且各给药组ROS均有降低(P<0.01);HO-1、GST、Keap1、NQO1和Nrf2的蛋白及mRNA表达均有不同程度增加(P<0.05,P<0.01)。结论:黄芩汤可以通过调控Nrf2通路发挥抗氧化应激的作用。

关键词：黄芩汤氧化应激 Caco-2细胞 RNA干扰核因子E_(2)相关因子2(Nrf2)信号通路

黄芩汤对溃疡性结肠炎小鼠Th17/Treg、Th1/Th2细胞平衡的影响

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中国实验方剂学杂志 2022年第22期28卷 7-15页

作者：刘滨刘雅清宋红新马旭冉王敦方冯雪杨伟鹏黑龙江中医药大学哈尔滨150040 中国中医科学院中药研究所北京100700

目的:研究黄芩汤对溃疡性结肠炎(UC)小鼠肠道辅助性T细胞(Th)17/调节性T细胞(Treg)、Th1/Th2细胞平衡的影响。方法:60只雄性C57BL/6J小鼠,按体质量随机分为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组(0.2 g·kg^(-1)),黄芩汤低、中、高剂量组(4.55... 详细信息

目的:研究黄芩汤对溃疡性结肠炎(UC)小鼠肠道辅助性T细胞(Th)17/调节性T细胞(Treg)、Th1/Th2细胞平衡的影响。方法:60只雄性C57BL/6J小鼠,按体质量随机分为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组(0.2 g·kg^(-1)),黄芩汤低、中、高剂量组(4.55、9.1、18.2 g·kg^(-1)),除正常组外均予以2.5%右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮水5 d诱导UC,连续灌胃给药7 d后处死小鼠,取肠系膜淋巴结(MLNs)和结肠组织,流式细胞术检测小鼠肠系膜淋巴结Th17/Treg、Th1/Th2,流式细胞微球芯片捕获技术检测结肠组织白细胞介素(IL)-2、IL-17A、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-4、IL-10等细胞因子含量,对结肠组织样本进行病理切片观察,并采用免疫组化法检测结肠组织中T细胞表达的T-box(T-bet)、GATA结合蛋白-3(GATA-3)、IL-17A、叉头蛋白P3(FoxP3)的表达水平,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠结肠组织中转化生长因子-β(TGF-β)的含量。结果:与正常组比较,模型组Th1、Th17细胞数量显著增高,而Th2、Treg细胞数量显著减少,Th1/Th2和Th17/Treg明显升高(P<0.05,P<0.01),小鼠结肠组织中T-bet、GATA-3、IL-17A、FoxP3表达明显升高(P<0.05,P<0.01),细胞因子IL-2、IL-17A、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量明显升高,IL-4、TGF-β、IL-10的含量明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,黄芩汤各剂量组均能逆转Th1/Th2和Th17/Treg细胞的比例失衡(P<0.01);黄芩汤低、中、高剂量组均可明显降低小鼠结肠T-bet、GATA-3的表达(P<0.05,P<0.01),黄芩汤高低剂量组可显著降低IL-17A的表达(P<0.01);黄芩汤高、中剂量组可显著降低细胞因子IL-2、IL-17A、IFN-γ、IL-6、TNF-α的含量,黄芩汤高剂量组还可明显增加TGF-β、IL-10的含量(P<0.05,P<0.01)。结论:黄芩汤可减轻UC小鼠结肠炎症,改善UC小鼠结肠组织损伤,这可能是通过调节Th17/Treg、Th1/Th2细胞平衡及相关细胞因子水平,调节促炎细胞因子的释放水平来实现的。

关键词：黄芩汤溃疡性结肠炎辅助性T细胞(Th)17/调节性T细胞(Treg)、Th1/Th2细胞平衡

黄芩汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响及肠黏膜屏障的保护作用机制

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中国实验方剂学杂志 2023年第7期29卷 11-19页

作者：刘雅清徐航宇王敦方刘滨马旭冉冯雪杨伟鹏中国中医科学院中药研究所北京100700 黑龙江中医药大学哈尔滨150040

目的:研究黄芩汤对溃疡性结肠炎(UC)模型小鼠的药效,并探究黄芩汤在UC中是否能调节肠道菌群,发挥屏障保护作用。方法:雄性Balb/c小鼠按体质量随机分为正常组、模型组、黄芩汤高(20 g·kg^(-1))、中(10 g·kg^(-1))、低(5 g·kg^(-1))剂... 详细信息

目的:研究黄芩汤对溃疡性结肠炎(UC)模型小鼠的药效,并探究黄芩汤在UC中是否能调节肠道菌群,发挥屏障保护作用。方法:雄性Balb/c小鼠按体质量随机分为正常组、模型组、黄芩汤高(20 g·kg^(-1))、中(10 g·kg^(-1))、低(5 g·kg^(-1))剂量组、菌群干扰组、菌群干扰模型组、菌群干扰黄芩汤组(黄芩汤,20 g·kg^(-1))。灌胃抗生素(杆菌肽200 mg·kg^(-1)、万古霉素200 mg·kg^(-1))8 d构建菌群干扰模型,自由饮用3%葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液7 d构建UC模型,黄芩汤给药治疗7 d。实验结束后处死小鼠,取血、结肠及粪便,苏木素-伊红(HE)染色观察结肠病变,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结肠组织中紧密连接蛋白1(Claudin1)、黏蛋白1(MUC1)、咬合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)mRNA和蛋白的表达,提取小鼠粪便DNA进行高通量测序分析。结果:与正常组比较,模型组小鼠血清IL-4、IL-6、TNF-α含量明显升高(P<0.05,P<0.01),IL-10明显降低(P<0.05);与模型组比较,黄芩汤给药组IL-4、IL-6、TNF-α含量下降(P<0.05,P<0.01),IL-10含量显著上升(P<0.01),Claudin1、MUC1、Occludin、ZO-1 mRNA和蛋白表达明显上升(P<0.05,P<0.01)。菌群干扰后,小鼠肠道菌物种多样性及丰度降低,变形菌门(Proteobacteria)增多(P<0.01),厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)减少(P<0.01);DSS诱发UC后,拟杆菌门和柔壁菌门(Tenericutes)明显减少(P<0.05);黄芩汤高、中、低3个剂量组中拟杆菌门、柔壁菌门明显增多(P<0.05,P<0.01),厚壁菌门减少(P<0.05),乳酸菌属(Lactobacillus)、毛螺菌属(Lachnospiraceae NK4A136 group)、大肠埃希菌志贺属(Escherichia-Shigella)、螺杆菌(Helicobacter)的丰度与黄芩汤剂量呈正比。结论:黄芩汤可以抑制UC小鼠的炎症反应,回调失衡的肠道菌群,修复损伤的肠黏膜屏障。

关键词：黄芩汤溃疡性结肠炎肠道菌群肠黏膜屏障

四神丸合痛泻要方治疗脾肾阳虚兼肝郁型溃疡性结肠炎的药效及作用机制

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中国实验方剂学杂志 2024年第7期30卷 40-48页

作者：刘雅清刘海帆刘滨冯雪张彩娟王敦方朱琳杨伟鹏中国中医科学院中药研究所北京100700 黑龙江中医药大学哈尔滨150040

目的:构建病证结合的脾肾阳虚兼肝郁型溃疡性结肠炎大鼠模型,并探究基于补脾柔肝、温肾固肠的治则合用四神丸与痛泻药方的药效与科学内涵。方法:60只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药美沙拉嗪组、四神丸合痛泻要方(合方)高、... 详细信息

目的:构建病证结合的脾肾阳虚兼肝郁型溃疡性结肠炎大鼠模型,并探究基于补脾柔肝、温肾固肠的治则合用四神丸与痛泻药方的药效与科学内涵。方法:60只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药美沙拉嗪组、四神丸合痛泻要方(合方)高、中、低剂量组。除正常组外其余各组大鼠每日给予番泻叶水煎剂、氢化可的松,并进行夹尾刺激,持续14 d。第14天刺激完毕后采用三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇混合溶液灌肠,诱导溃疡性结肠炎(UC)模型。造模第15天开始给药,期间持续观察并记录大鼠体质量、精神状态等。第25天开展糖水偏好实验。第28天测量大鼠肛温,并灌胃给予大鼠3%D-木糖溶液10 m L·kg^(-1),1 h后取血测量血清中D-木糖含量。第29天取材,收集血清、结直肠与海马体。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定大鼠血清中胃泌素(GAS)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)、环磷酸腺苷(c AMP)、环磷酸鸟苷(c GMP)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)与海马体中5-羟色胺(5-HT)含量。苏木素-伊红(HE)染色观察结肠病变,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结肠组织中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路相关蛋白p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的mRNA和蛋白的表达。结果:造模期间,与正常组比较,模型组大鼠体质量明显下降,肛温、血清D-木糖含量下降,GAS含量显著上升(P<0.01);血清c AMP/c GMP比例失衡,ACTH、CORT含量显著减少(P<0.01);糖水饮用比例减少,海马体5-HT含量显著降低(P<0.01)。结直肠长度显著缩短(P<0.01),HE染色可见大量炎性细胞浸润,结肠组织结构破坏严重。给药后,合方高、中、低剂量组均可明显改善上述指标(P<0.05,P<0.01),并能减轻炎性浸润,修复组织病理损伤。与正常组比较,模型组大鼠血清中IL-4浓度显著降低(P<0.01),TNF-α与IFN-γ浓度明显升高(P<0.05,P<0.01)。p38 MAPK、ERK与JNK表达均明显上升(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,合方组大鼠IL-4含量显著增加(P<0.01),TNF-α、IFN-γ含量则明显减少(P<0.05,P<0.01),在基因水平与蛋白水平上均明显降低p38 MAPK、ERK、JNK的表达(P<0.05,P<0.01)。结论:该实验成功构建了脾肾阳虚兼肝郁型溃疡性结肠炎大鼠病证结合模型,四神丸合痛泻要方能显著改善大鼠的证候表现,并能改善大鼠结肠部位炎症反应,下调MAPK通路表达。推测四神丸合痛泻要方可能通过抑制MAPK通路治疗脾肾阳虚兼肝郁型溃疡性结肠炎。

关键词：证候脾肾阳虚肝郁溃疡性结肠炎丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)

黄芩汤对结肠炎相关性结肠癌肠道炎症和增殖的干预机制

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中国实验方剂学杂志 2023年第22期29卷 1-10页

作者：朱琳王敦方冯雪张彩娟刘海帆刘雅清刘滨刘丽杨伟鹏黑龙江中医药大学哈尔滨150040 中国中医科学院中药研究所北京100700

目的:研究黄芩汤对结肠炎相关性结肠癌(CAC)小鼠模型的药效,并探究黄芩汤在CAC中调节免疫功能和炎症反应,抑制细胞异常增殖,延缓或抑制CAC形成的机制。方法:C57BL/6J小鼠按体质量随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组、黄芩汤高、低剂量... 详细信息

目的:研究黄芩汤对结肠炎相关性结肠癌(CAC)小鼠模型的药效,并探究黄芩汤在CAC中调节免疫功能和炎症反应,抑制细胞异常增殖,延缓或抑制CAC形成的机制。方法:C57BL/6J小鼠按体质量随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组、黄芩汤高、低剂量组,每组12只,除正常组外其余小鼠均给予2次腹腔注射10 mg·kg^(-1)氧化偶氮甲烷(AOM),1.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮用7 d,正常饮水2周,“DSS-饮水”重复2个循环。在给予DSS同时,正常组和模型组小鼠给予纯水等剂量灌胃;美沙拉嗪组小鼠给予150 mg·kg^(-1)·d(-1)美沙拉嗪混悬液灌胃;黄芩汤高、低剂量组小鼠分别给予黄芩汤18、9 g·kg^(-1)·d(-1)灌胃;各组均每日给药1次,直至3个循环结束。干预结束后,测量各组小鼠体质量、结肠长度、记录小鼠结肠肿瘤数目,并进行疾病活动指数(DAI)评分。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-4、IL-10及胃肠道肿瘤标志物糖类抗原-199(CA199)含量;苏木素-伊红(HE)染色观察结肠病变;免疫组化法观察结肠增殖细胞相关抗原(Ki67)表达变化;流式法检测小鼠血浆中T淋巴细胞亚群(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD49b^(+))表达;荧光标记法检测小鼠血清中异硫氰酸荧光素-D(FITC-D)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结肠组织细胞周期相关蛋白细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶-2(CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、紧密连接相关蛋白咬合蛋白(Occludin)、闭合蛋白-1(Claudin-1)蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠体质量下降,DAI评分明显升高,结肠长度变短,IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎因子均升高,其中IL-6、TNF-α升高明显(P<0.05)。抑炎因子IL-4明显降低(P<0.05),IL-10降低;肿瘤标志物CA199显著升高(P<0.01);HE染色结果显示模型组小鼠结肠出现瘤性病变,肠黏膜上皮缺损伴大量炎性浸润,隐窝破坏严重,腺体排列紊乱;Ki67阳性颗粒在结肠组织大面积表达;模型组小鼠血清CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)均明显降低(P<0.05),CD8^(+)明显升高(P<0.05);模型组小鼠血浆中FITC-D含量明显增加(P<0.05);结肠组织Cyclin D1、CDK2、CDK4蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01),Occludin、Claudin-1蛋白表达均显著降低(P<0.01)。与模型组比较,美沙拉嗪组和黄芩汤高、低剂量组小鼠体质量增加,DAI评分下降,结肠变长;IL-6、TNF-α、IL-1β表达下降(P<0.05,P<0.01),IL-4、IL-10差异无统计学意义;CA199含量明显降低(P<0.05);美沙拉嗪组和黄芩汤组小鼠结肠瘤性病变和炎性浸润减轻,隐窝结构破坏较轻;Ki67阳性表达降低;CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、CD49b^(+)均有所增加,差异无统计学意义,FITC-D含量减少(P<0.05),黄芩汤高剂量组Cyclin D1、CDK2、CDK4蛋白表达下降(P<0.05,P<0.01),Claudin-1、Occludin蛋白表达增多(P<0.05)。结论:黄芩汤对AOM/DSS诱发的炎癌转化有一定延缓和抑制作用,其作用机制可能与调节免疫功能和炎症反应,抑制促炎因子释放,修复受损的肠道屏障,抑制结肠细胞异常增殖,进而干预CAC结肠肿瘤的形成和发展有关。

关键词：结直肠癌炎症通透性增殖黄芩汤

黄芩汤对炎症相关性结直肠癌小鼠炎症及短链脂肪酸相关肠道菌群的影响

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中国实验方剂学杂志 2024年第23期30卷 157-169页

作者：朱琳王敦方冯雪张彩娟刘海帆刘雅清刘滨刘丽陈思源杨伟鹏中国中医科学院中药研究所北京100700 黑龙江中医药大学哈尔滨150040

目的:构建氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)炎症相关性结直肠癌(CAC)小鼠模型,采用16S rRNA高通量测序方法,探讨CAC模型小鼠发生发展进程中黄芩汤对小鼠肠道菌群结构的影响。方法:将225只C57BL/6J小鼠随机分为5组,分别为正常组、模... 详细信息

目的:构建氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)炎症相关性结直肠癌(CAC)小鼠模型,采用16S rRNA高通量测序方法,探讨CAC模型小鼠发生发展进程中黄芩汤对小鼠肠道菌群结构的影响。方法:将225只C57BL/6J小鼠随机分为5组,分别为正常组、模型组、美沙拉嗪组、黄芩汤高、低(18、9 g·kg^(-1))剂量组。每组45只,除正常组外,每只小鼠在1周内分别于第1天和第5天进行10 mg·kg^(-1) AOM注射,然后给予1.5%DSS溶液7 d,之后更换为无菌水14 d,此为1周期,共计3周期。在给予DSS第1天同时给予美沙拉嗪和黄芩汤高、低剂量组药物灌胃,正常组和模型组给予纯水进行灌胃,每日1次,直至3个周期结束。根据CAC发病进程,分为炎症阶段、增殖阶段及肿瘤生成阶段。每个周期结束后,分别测量各组小鼠体质量、结肠长度、记录小鼠结肠肿瘤数目,并进行疾病活动指数(DAI)评分。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测每个周期小鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及胃肠道肿瘤标志物糖类抗原199(CA199)含量;苏木素-伊红(HE)染色观察结肠病变。同时,采集正常组、模型组和黄芩汤高剂量组小鼠新鲜粪便3~5粒,按照DNA提取试剂盒说明书步骤提取小鼠粪便DNA,进行16S rRNA高通量测序并分析结果。结果:与正常组比较,模型组小鼠3个阶段体质量显著下降(P<0.01),DAI评分逐渐上升,结肠长度明显缩短(P<0.05)。与正常组比较,增殖阶段模型组小鼠,IL-1β表达上升(P<0.05),IL-6、TNF-α表达明显上升(P<0.05);CA199在炎症和增殖阶段升高,肿瘤阶段显著升高(P<0.01)。HE病理结果显示,与正常组比较,模型组小鼠,炎症阶段炎症细胞浸润明显,随着疾病进展到增殖和肿瘤阶段,肌层增厚,黏膜层细胞异常增生,最终形成晚期高级别上皮内肿瘤病变。黄芩汤给药后,与模型组比较,在炎症、增殖和肿瘤生成阶段各组小鼠体质量未见明显改善,DAI评分降低,结肠长度增加;肿瘤生成阶段结肠长度显著增加(P<0.01)。在肿瘤生成阶段,黄芩汤给药组显著抑制了肿瘤生成和生长,CAC小鼠肿瘤数目显著减少(P<0.01)。黄芩汤高、低剂量组IL-6、TNF-α、IL-1β在炎症、增殖和肿瘤阶段降低,IL-6、TNF-α 3个阶段均明显降低(P<0.05,P<0.01);CA199在炎症阶段降低,增殖和肿瘤阶段明显降低(P<0.05,P<0.01)。HE结果显示,与模型组比较,给药组有效减轻了炎症反应、异常细胞增殖,延缓了肿瘤发生。肠道菌群结果显示,与正常组比较,在炎症、增殖和肿瘤生成阶段,模型组小鼠Alpha、Beta多样性降低,肠道菌群结构变化明显。与模型组比较,黄芩汤给药后,在肿瘤生成阶段明显调节模型小鼠的物种数量及Alpha、Beta多样性。黄芩汤给药后,在炎症、增殖和肿瘤生成阶段纠正肠道菌群回归正常丰度与多样性;在炎症阶段,门水平上,正向调节了小鼠的2种差异菌门(厚壁菌门、拟杆菌门)与3种差异菌属(Muribaculaceae、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Flavonifractor);在增殖阶段,门水平上,正向调节了小鼠的2种差异菌门(拟杆菌门、髌骨菌门)与5种差异菌属(Muribaculaceae、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Candidatus_Saccharimonas、norank_f__UCG-010、Allobaculum);肿瘤生成阶段,正向调节了小鼠的2种差异菌门(变形菌门、髌骨菌门)与8种差异菌属(Muribaculaceae、Candidatus_Saccharimonas、norank_f__UCG-010、Lachnospiraceae_UCG-006、Allobaculum、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Flavonifractor)。结论:黄芩汤能够较好地干预AOM/DSS诱发的小鼠结肠炎癌转化进程,其作用机制可能与其纠正CAC模型小鼠炎症和短链脂肪酸相关菌群紊乱,直接或间接延缓结肠炎癌转化相关。

关键词： 16S rRNA 肠道菌群炎症炎癌转化黄芩汤