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原核细胞中可调控人工转录元件的构建与表征

基因组学与应用生物学 2020年第6期39卷 2692-2697页

作者：金倩杨胜利魏东芝马昱澍华东理工大学生物反应工程国家重点实验室鲁华所上海200237 上海交通大学系统生物学研究所上海200240

人工转录装置可以按照所设计的方式在原核细胞和真核细胞中调节基因表达。本研究在大肠杆菌中设计并构建了一种由合成启动子和人工转录因子构成的人工转录装置:其中,合成启动子包含了一种弱启动子Plac突变体与位于其上游的λ噬菌体操纵... 详细信息

人工转录装置可以按照所设计的方式在原核细胞和真核细胞中调节基因表达。本研究在大肠杆菌中设计并构建了一种由合成启动子和人工转录因子构成的人工转录装置:其中,合成启动子包含了一种弱启动子Plac突变体与位于其上游的λ噬菌体操纵区(OR2或OR3)的不同组合,而人工转录因子则利用细菌RNA聚合酶α亚基的N端和λ噬菌体CI蛋白的C端组成的融合蛋白α-CI作为效应域,CI蛋白作为DNA结合结构域。利用绿荧光蛋白作为报告基因对这一人工转录装置检测发现,它可以成功开启报告基因的转录活性。随后通过改变这一人工转录装置的某些参数,例如,增加启动子上游操纵序列的拷贝数、使用温敏型CI取代野生型CI、在系统中引入CI的阻遏蛋白Cro等多种方式,实现了对报告基因转录强度的精细调控。这一人工可调控转录装置可以在原核细胞中实现对报告基因表达强度的精细调控,在原核细胞中调节基因线路的信号输出强度方面具有一定的应用前景。

关键词：合成生物学转录因子可编程转录调控

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应用荧光分析法检测酶的研究进展

生物工程学报 2009年第12期25卷 1765-1769页

作者：邢艳珑毛相朝王舒王华磊魏东芝中国科学院青岛生物能源与过程研究所青岛266101

酶是细胞新陈代谢的基础,酶的检测在生物技术、疾病诊断及药物开发等领域都具有十分重要的意义。在检测酶的诸多方法中,荧光法因其灵敏度高、检测限低等优势发展迅速。以下简述了近年来荧光法在酶检测领域的研究,根据检测方法的不同分... 详细信息

酶是细胞新陈代谢的基础,酶的检测在生物技术、疾病诊断及药物开发等领域都具有十分重要的意义。在检测酶的诸多方法中,荧光法因其灵敏度高、检测限低等优势发展迅速。以下简述了近年来荧光法在酶检测领域的研究,根据检测方法的不同分为直接荧光检测法和间接荧光检测法,其中直接检测法又根据不同的底物标记及检测机理进行分类。以下介绍了各种方法的应用,并展望了此类方法的前景和发展趋势,为酶工程及生命科学其他领域的相关研究提供信息。

关键词：荧光探针酶检测

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纤维素酶蛋白质工程的新进展

江西师范大学学报（自然科学版） 2015年第4期39卷 425-429页

作者：赵喜华涂宗财魏东芝王玮唐平平江西师范大学生命科学学院江西南昌330022 华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所上海200237

原始纤维素酶通常存在催化活性低下、末端产物抑制、热稳定性不高、持续催化能力弱等问题,因此,改善它的酶学性质是很有意义的工作.目前,采用体外进化技术是改进纤维素酶酶学性质的一种有效途径.从纤维酶的催化域、结合域和连接区等不... 详细信息

原始纤维素酶通常存在催化活性低下、末端产物抑制、热稳定性不高、持续催化能力弱等问题,因此,改善它的酶学性质是很有意义的工作.目前,采用体外进化技术是改进纤维素酶酶学性质的一种有效途径.从纤维酶的催化域、结合域和连接区等不同区域出发,综述了纤维素酶蛋白质工程的新进展.提出了系统组装3个已改造功能结构域的思想,这有助于提高纤维素酶催化活性、持续催化能力、耐高浓度产物、热稳定性等特性,将促进纤维素酶在能源、工业、农业、食品等领域的高效应用.

关键词：纤维素酶蛋白质工程新进展

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车用可调阻尼减振器参数优化分析及实验验证

机械设计与研究 2023年第6期39卷 75-79页

作者：张梅红魏冬至张明柱河南工业贸易职业学院机电工程学院郑州451191 郑州技师学院机械制造系郑州450000 河南科技大学机电工程学院郑州450000

为了提高汽车行驶过程中不同路面的平顺性和运行稳定性,在分析阻尼调节阀结构的基础上,设计了一种具有阻尼调节阀的液压减振器。该减振器中的阀芯在衔铁推动下发生运动,实现进出油口流量与压力调节,达到减振器呈现阻尼特性的效果。研究... 详细信息

为了提高汽车行驶过程中不同路面的平顺性和运行稳定性,在分析阻尼调节阀结构的基础上,设计了一种具有阻尼调节阀的液压减振器。该减振器中的阀芯在衔铁推动下发生运动,实现进出油口流量与压力调节,达到减振器呈现阻尼特性的效果。研究结果表明:改变激励电压并不会造成响应时间的明显变化。增大阀芯负载压差将引起阀芯上升时间增加并达到更长的响应时间。随着阻尼系数的提高,上升时间也发生了逐渐增加。当提高衔铁质量后,阀芯可以在更短时间内完成触动响应,阀芯需经过更长时间完成上升与响应过程。通过实验验证了该可调阻尼减振器设计满足目标阻尼的要求,对提高汽车运行舒适性具有很好的理论价值,且易于推广。

关键词：液压减振器阻尼调节阀动态特性参数优化激励电压

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青霉素酰化酶表达调控的研究进展

生物技术通报 2009年第9期25卷 34-37页

作者：蒋咏梅章文贤魏东芝福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心福建师范大学生命科学学院福建省现代发酵技术工程研究中心福州350108 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所上海200237

青霉素酰化酶(penicillin acylase,PAC)是抗生素工业的重要酶。它在大肠杆菌中需经过复杂的转录、翻译和后翻译才能成熟,且后翻译过程对活性酶的最终形成影响很大。在阐述PAC的苯乙酸诱导机制的基础上,详细论述了PAC的后翻译过程,并对... 详细信息

青霉素酰化酶(penicillin acylase,PAC)是抗生素工业的重要酶。它在大肠杆菌中需经过复杂的转录、翻译和后翻译才能成熟,且后翻译过程对活性酶的最终形成影响很大。在阐述PAC的苯乙酸诱导机制的基础上,详细论述了PAC的后翻译过程,并对几种主要的影响因素进行了分析。

关键词：青霉素酰化酶大肠杆菌诱导机制后翻译过程影响因素

短小芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

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生物技术通报 2014年第4期30卷 132-138页

作者：苏二正吴向萍高蓓魏东芝南京林业大学轻工科学与工程学院酶与发酵工程实验室南京210037 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所上海200237

从土壤样品中通过筛菌过程获得一株产脂肪酶的菌株,经16S rRNA鉴定属于短小芽孢杆菌,根据已报道的来源于芽孢杆菌的脂肪酶基因设计引物,克隆获得其全长基因,命名为lipS6,大小为648 bp,编码215个氨基酸,经比对其与已报道的脂肪酶基因B26... 详细信息

从土壤样品中通过筛菌过程获得一株产脂肪酶的菌株,经16S rRNA鉴定属于短小芽孢杆菌,根据已报道的来源于芽孢杆菌的脂肪酶基因设计引物,克隆获得其全长基因,命名为lipS6,大小为648 bp,编码215个氨基酸,经比对其与已报道的脂肪酶基因B26有96%的同源性。构建重组表达质粒pET32a-lipS6,在大肠杆菌中实现了可溶表达,酶活达到2 000 U/mL。重组脂肪酶LipS6的最适温度为30℃,最适pH为9,低浓度的Ca2+与Mn2+对其有很明显的激活作用,疏水性有机溶剂对其毒害作用小,在正己烷体系中可以催化酯化反应,最适酯化底物酸为十四酸,底物醇为正丁醇。

关键词：脂肪酶短小芽孢杆菌基因克隆重组表达性质

固定化唾液酸酶催化多唾液酸神经节苷脂制备GM1

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中国医药工业杂志 2012年第10期43卷 821-823,841页

作者：沈丹虹彭彦峰王学东魏东芝华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

对一种来源于乳酪短杆菌的唾液酸酶进行固定化并考察其催化性质。使用HZ841大孔吸附树脂固定化唾液酸酶,确定固定化条件:15～25℃,pH 5.4,每克载体以酶液15 ml(30 u/ml)固定化16 h。固定化唾液酸酶在pH 5～9范围内活性良好,40℃时酶活... 详细信息

对一种来源于乳酪短杆菌的唾液酸酶进行固定化并考察其催化性质。使用HZ841大孔吸附树脂固定化唾液酸酶,确定固定化条件:15～25℃,pH 5.4,每克载体以酶液15 ml(30 u/ml)固定化16 h。固定化唾液酸酶在pH 5～9范围内活性良好,40℃时酶活力半衰期由30 min延长至2 h以上,其pH稳定性和热稳定性较游离酶均有所提高。利用固定化唾液酸酶转化多唾液酸神经节苷脂为单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1),TLC法测得催化前后GM1在神经节苷脂混合物中的相对含量由9%提高到60%。

关键词：乳酪短杆菌唾液酸酶固定化单唾液酸四己糖神经节苷脂

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醇脱氢酶不对称还原制备手性醇的研究进展

化工进展 2011年第7期30卷 1562-1569页

作者：谌容王秋岩殷晓浦魏东芝谢恬生物医药与健康研究中心杭州师范大学浙江杭州310012 生物反应器工程国家重点实验室华东理工大学鲁华生物技术研究所上海200237

从醇脱氢酶在不对称还原制备手性醇化合物的应用出发,进行3个重要方面综述:酶分子——作为优质高效的生物催化剂,对红球菌属、乳酸菌属、赖氏菌属及嗜热微生物来源的天然或重组醇脱氢酶的催化作用进行探讨;辅酶的再生方法及优缺点分析... 详细信息

从醇脱氢酶在不对称还原制备手性醇化合物的应用出发,进行3个重要方面综述:酶分子——作为优质高效的生物催化剂,对红球菌属、乳酸菌属、赖氏菌属及嗜热微生物来源的天然或重组醇脱氢酶的催化作用进行探讨;辅酶的再生方法及优缺点分析——探索适合于特定催化反应的再生方法,以解决大规模应用时添加昂贵的辅酶带来的成本问题;体外进化技术——对目的酶活性、立体选择性与稳定性的提高。最终为酶催化制备医药及精细化工品中间体建立一条绿色高效经济的途径。

关键词：醇脱氢酶手性中间体辅酶再生体外进化

CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展

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合成生物学 2023年第1期4卷 47-66页

作者：柳柯林桂虹刘坤周伟王风清魏东芝华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所上海200237

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)是一种微生物获得性免疫系统,自从证实其可用于基因编辑之后,迅速增强了我们编辑、操纵、注释、检测甚至成像生物体DNA和RNA的能力,为基础生命科学、医学和生物工程等领域的创新发... 详细信息

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)是一种微生物获得性免疫系统,自从证实其可用于基因编辑之后,迅速增强了我们编辑、操纵、注释、检测甚至成像生物体DNA和RNA的能力,为基础生命科学、医学和生物工程等领域的创新发展注入了强劲动力,快速推动了合成生物学等学科的兴盛发展。然而,CRISPR/Cas系统也有一些固有的问题,例如脱靶效应、原间隔序列邻近基序(PAM)对靶目标的约束性以及基因编辑活性的可控性等,严重制约了该系统在基因精准可控编辑等方面的长足发展,阻碍了其新功能和新应用的拓展。为了突破这些限制,“蛋白质工程修饰Cas蛋白”与“基于生物信息学的新型CRISPR/Cas系统的挖掘”就成为完善发展CRISPR/Cas系统以及扩充CRISPR工具箱的两种重要策略。本文主要针对当前应用最为广泛的Ⅱ类CRISPR/Cas系统,重点介绍了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a这三种代表性系统的基本结构和作用机制,及其在结构改造和功能拓展等方面的新进展,同时也对一些新近发掘的具有重要特色和潜在应用价值的CRISPR/Cas系统进行了综述,例如CRISPR/CasФ和CRISPR/Cas12k。这些改造和发掘工作显著改善了CRISPR/Cas系统的固有问题,有力地拓展了其功能和适用性,势必会进一步快速推动CRISPR/Cas系统在诸多领域的创新发展。

关键词： CRISPR/Cas 基因编辑脱靶效应 PAM约束 Cas工程改造