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猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

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中国农业科学 2020年第8期53卷 1664-1676页

作者：秦本源杨阳张燕伟刘敏张万锋王海珍吴怡琦张雪莲蔡春波高鹏飞郭晓红李步高曹果清山西农业大学动物科技学院

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的... 详细信息

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P<0.01);CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著(P<0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。

关键词：猪卫星细胞分离培养鉴定分化

miR-145-5p靶向IGF 1R介导AKT通路抑制猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化

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畜牧兽医学报 2023年第5期54卷 1893-1904页

作者：员佳乐刘畅黄晓宇刘巧霞史明月李文霞牛瑾王首元高鹏飞郭晓红李步高路畅曹果清山西农业大学动物科学学院太谷030801 山西省畜牧技术推广服务中心太原030001

旨在探讨miR-145-5p对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究采用qRT-PCR检测miR-145-5p的组织表达谱和发育性表达规律;选用1 d晋汾白猪趾长伸肌进行骨骼肌卫星细胞的分离与培养,分别转染miR-145-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics... 详细信息

旨在探讨miR-145-5p对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究采用qRT-PCR检测miR-145-5p的组织表达谱和发育性表达规律;选用1 d晋汾白猪趾长伸肌进行骨骼肌卫星细胞的分离与培养,分别转染miR-145-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics NC),miR-145-5p抑制剂(inhibitor)及其对照组(inhibitor NC),每个处理3个重复,利用qRT-PCR、EdU和CCK-8方法检测增殖相关基因表达量、EdU阳性细胞数和细胞增殖活性;待猪骨骼肌卫星细胞分化后利用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色方法探究分化相关基因mRNA和蛋白水平及肌管形成情况;采用双荧光素酶试验、qRT-PCR和Western blot探究miR-145-5p对下游IGF 1R和AKT通路的影响。结果显示,miR-145-5p基因在肝和肺中表达量最高,心和皮下脂肪中次之(P<0.05);随着日龄的增加,miR-145-5p在猪背最长肌中的表达量持续升高(P<0.05)。在猪骨骼肌卫星细胞体外培养过程中,转染miR-145-5p mimics极显著下调Ki 67和CDK 1的表达(P<0.01),显著下调PCNA和CDK 4的表达(P<0.05),阳性细胞指数极显著降低(P<0.01),细胞活性显著低于对照组(P<0.05)。在分化方面,过表达miR-145-5p极显著下调MyOD、MyOG和Myf 5的表达量(P<0.01),MyOD蛋白水平显著降低(P<0.05),MyHC阳性肌管面积少于对照组;转染miR-145-5p inhibitor则出现相反的结果。过表达miR-145-5p显著降低IGF1R mRNA和蛋白的相对表达量(P<0.05),显著降低AKT蛋白的磷酸化水平;而干扰miR-145-5p能极显著上调IGF1R mRNA和蛋白的相对表达量(P<0.01),并能挽救转染si-IGF1R对p-AKT蛋白的抑制作用(P<0.01)。本研究结果表明,miR-145-5p通过负调控IGF1R mRNA和蛋白的相对表达水平,并影响AKT通路,抑制猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化,进而参与骨骼肌的发育过程。研究结果丰富了猪肌肉生长发育的分子网络,并为肌肉性状的分子育种提供了靶标。

关键词： miR-145-5p IGF 1R AKT通路增殖和分化骨骼肌卫星细胞

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DNA甲基化与去甲基化调控脂肪沉积的研究进展

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中国畜牧兽医 2019年第2期46卷 519-525页

作者：王鹤洁秦本源王媛媛郭玉龙宋鹏康刘亚丹乐宝玉张宁芳成志敏高鹏飞郭晓红李步高曹果清山西农业大学动物科技学院太谷030801

脂肪沉积是一个复杂的生物学过程,受遗传和表观遗传的调控作用。DNA甲基化和去甲基化是表观遗传修饰的重要方式,可通过与转录因子的相互作用或改变染色质的结构调控基因的表达,进而参与机体生长发育和细胞分化等重要的生命过程。动物脂... 详细信息

脂肪沉积是一个复杂的生物学过程,受遗传和表观遗传的调控作用。DNA甲基化和去甲基化是表观遗传修饰的重要方式,可通过与转录因子的相互作用或改变染色质的结构调控基因的表达,进而参与机体生长发育和细胞分化等重要的生命过程。动物脂肪沉积是脂肪细胞增殖分化和肥大的结果,脂肪细胞分化是由多能干细胞经前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞转化的过程。相关研究表明,转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxi-some proliferator activiated receptorγ,PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白家族(CCAAT enchancer binding proteinfamily,CEBPs)在脂肪沉积过程中起关键调控作用。近期研究发现,DNA甲基化可以通过调控脂肪形成过程中相关基因的表达而参与脂肪细胞的分化和脂肪组织的生长发育。去甲基化也可影响动物脂肪沉积过程,但其具体机制目前尚不清楚。作者主要介绍了DNA甲基化和去甲基化的定义、发生位点、生物学功能、参与DNA甲基化和去甲基化过程中的酶及其作用机制,概述了脂肪沉积过程及PPARγ、C/EBPα等转录因子在脂肪沉积过程中的调控作用,重点阐述了DNA甲基化和去甲基化对脂肪形成相关基因的表达和对脂肪细胞分化的影响,旨在为阐明脂肪沉积机制及改善动物肉质品质提供参考。

关键词： DNA甲基化去甲基化脂肪沉积调控

猪骨骼肌纤维类型和能量代谢相关基因的表达特性研究

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中国畜牧兽医 2022年第4期49卷 1223-1232页

作者：张燕伟蔡春波孙迪安家岐黄晓宇牛瑾崔子旭高鹏飞郭晓红李步高曹果清山西农业大学动物科学学院太谷030801

【目的】研究马身猪、晋汾白猪和杜长大猪骨骼肌肌纤维类型和能量代谢相关基因的表达特性。【方法】选取6月龄马身猪、晋汾白猪和杜长大猪,屠宰后采集背最长肌和趾长伸肌,采用HE染色检测肌纤维的直径、密度和横截面积,通过实时荧光定量... 详细信息

【目的】研究马身猪、晋汾白猪和杜长大猪骨骼肌肌纤维类型和能量代谢相关基因的表达特性。【方法】选取6月龄马身猪、晋汾白猪和杜长大猪,屠宰后采集背最长肌和趾长伸肌,采用HE染色检测肌纤维的直径、密度和横截面积,通过实时荧光定量PCR分别检测Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型和Ⅱx型肌纤维的标记基因(MYH7、MYH2、MYH4和MYH1),线粒体活性相关基因(ATP5A1、PGC1-α和PPARβ),电子传递链活性相关基因(UQCRC2、SDHA、NDUFA9),以及糖酵解活性相关基因(LDHA、LDHB和GK)的表达量。【结果】马身猪背最长肌肌纤维直径和横截面积均显著低于晋汾白猪和杜长大猪,而密度显著高于晋汾白猪和杜长大猪(P<0.05);马身猪和晋汾白猪趾长伸肌肌纤维直径和横截面积均显著低于杜长大猪,而密度显著高于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌MYH7基因的表达量最高,晋汾白猪最低;马身猪和晋汾白猪趾长伸肌MYH7基因的表达量显著高于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌和趾长伸肌MYH2基因的表达量显著高于晋汾白猪和杜长大猪,晋汾白猪趾长伸肌MYH2基因的表达量显著高于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌MYH4基因的表达量显著低于晋汾白猪和杜长大猪,马身猪和晋汾白猪趾长伸肌MYH4基因的表达量显著低于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌中ATP5A1和PGC1-α基因的表达量均显著低于晋汾白猪和杜长大猪,晋汾白猪PGC1-α和PPARβ基因的表达量均显著低于杜长大猪(P<0.05);马身猪和晋汾白猪趾长伸肌中ATP5A1、PGC1-α和PPARβ基因的表达量均显著低于杜长大猪(P<0.05)。晋汾白猪背最长肌中UQCRC2、SDHA和NDUFA9基因的表达量均显著低于杜长大猪和马身猪(P<0.05);晋汾白猪和马身猪趾长伸肌中UQCRC2、SDHA和NDUFA9基因的表达量均显著低于杜长大猪,马身猪UQCRC2和SDHA基因的表达量均显著低于晋汾白猪(P<0.05)。晋汾白猪和马身猪背最长肌和趾长伸肌中LDHA、LDHB和GK基因的表达量均显著低于杜长大猪(P<0.05)。【结论】马身猪骨骼肌肌纤维直径和横截面积都较小,Ⅰ型和Ⅱa型肌纤维标记基因的表达量较高;杜长大猪骨骼肌Ⅱb型肌纤维标记基因的表达量较高,氧化磷酸化和糖酵解相关基因的表达量均较高。

关键词：猪肌纤维类型氧化磷酸化糖酵解

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3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

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中国畜牧兽医 2020年第5期47卷 1352-1359页

作者：张万锋黑伟何志强刘敏孟珊高鹏飞蔡春波杨阳郭晓红曹果清李步高山西农业大学动物科技学院太谷030801

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧... 详细信息

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。

关键词： PK15细胞 NR2F2基因脂质体转染电穿孔转染慢病毒转染

猪CCAR1基因细胞定位、表达特性及对细胞增殖的影响

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畜牧兽医学报 2020年第11期51卷 2651-2664页

作者：张宁芳吴怡琦成志敏杨晓伟李萌杨阳刘宏高鹏飞蔡春波郭晓红李步高曹果清山西农业大学动物科学学院太谷030801 山西省高等创新研究院太原030032 大同海关技术中心大同037000 大同市种猪场大同037000

旨在获得猪CCAR1基因的完整CDS序列,研究其亚细胞定位和表达特性,探究其对细胞增殖的影响和作用机制。本研究以1日龄马身猪肾组织cDNA为模板,采用RT-PCR技术分段扩增猪CCAR1基因的CDS区,通过测序和序列拼接获得完整CDS区;采用细胞免疫... 详细信息

旨在获得猪CCAR1基因的完整CDS序列,研究其亚细胞定位和表达特性,探究其对细胞增殖的影响和作用机制。本研究以1日龄马身猪肾组织cDNA为模板,采用RT-PCR技术分段扩增猪CCAR1基因的CDS区,通过测序和序列拼接获得完整CDS区;采用细胞免疫荧光技术检测CCAR1在PK15细胞中的定位;采用qRT-PCR技术检测猪CCAR1基因的时空表达规律;采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除PK15细胞的CCAR1基因,通过qRT-PCR、Western blot以及CCK8(cell counting kit 8)技术检测CCAR1基因敲除对细胞增殖能力及细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响。结果表明,猪CCAR1基因的完整CDS区长3459 bp(MH301308.1),在PK15细胞的细胞质和细胞核中均有表达。大白猪和马身猪不同组织CCAR1的表达谱基本相似,在所检测的组织中均有表达,均表现为在肾和小肠中表达量最高,在脾、肝、小脑和肌肉中呈中度表达,在心和皮下脂肪中低表达;CCAR1基因在大白猪和马身猪初生、3月龄和6月龄3个年龄阶段的两种骨骼肌中也均有表达。CRISPR/Cas9基因编辑系统能有效降低CCAR1的表达,在转染48 h后,相比于对照组,试验组都对细胞增殖产生极显著抑制(P<0.01);CCAR1基因敲除后,细胞增殖标记基因Mki67表达水平显著下降(P<0.05),Wnt通路下游靶基因C-myc表达量显著下降(P<0.05),Wnt通路核心蛋白β-catenin和凋亡标记基因Caspase3的表达量无显著差异。CCAR1基因在猪不同组织和不同发育阶段均有表达,可能通过调控细胞增殖基因Mki67和Wnt通路下游靶基因C-myc的表达而影响细胞增殖,在猪的生长发育过程中起重要作用。

关键词：猪 CCAR1基因细胞定位表达特征基因敲除细胞增殖

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UCP3基因调控C2C12细胞增殖的研究

山西农业大学学报（自然科学版） 2021年第2期41卷 74-82页

作者：何志强黑伟张万锋张燕伟吴怡琦蔡春波杨阳高鹏飞李步高郭晓红山西农业大学动物科学学院山西太谷030801

[目的]本文旨在探究UCP3基因对C2C12成肌细胞增殖的调控作用。[方法]构建慢病毒包被的UCP3基因过表达和干扰载体,转染C2C12细胞,分别促进和抑制UCP3基因的表达;通过CCK-8和EDU染色试验检测C2C12细胞的增殖效果,采用qRT-PCR技术检测细胞... 详细信息

[目的]本文旨在探究UCP3基因对C2C12成肌细胞增殖的调控作用。[方法]构建慢病毒包被的UCP3基因过表达和干扰载体,转染C2C12细胞,分别促进和抑制UCP3基因的表达;通过CCK-8和EDU染色试验检测C2C12细胞的增殖效果,采用qRT-PCR技术检测细胞增殖和凋亡的相关基因表达量的变化,利用Western Blot方法检测细胞增殖关键蛋白PCNA的变化。[结果]CCK-8和EDU染色试验结果发现,与过表达对照组(OE-NC)相比,UCP3基因过表达组(OE-UCP3)细胞的增殖速度极显著降低(P<0.01),细胞增殖相关基因PCNA和Ki67的mRNA表达量极显著降低(P<0.01),细胞凋亡相关基因Bax和caspase3的表达量极显著升高(P<0.01);细胞增殖关键蛋白PCNA的含量也极显著降低(P<0.01)。与干扰对照组(Sh-NC)相比,UCP3基因干扰组(Sh-UCP3)细胞的增殖速度显著增加(P<0.05),细胞增殖相关基因PCNA和Ki67的mRNA表达量极显著增加(P<0.01),细胞凋亡相关基因Bax和caspase3的表达量显著降低(P<0.05),细胞增殖关键蛋白PCNA的含量也显著升高(P<0.05)。[结论]UCP3基因可能通过抑制细胞增殖基因PCNA和Ki67的表达,促进细胞凋亡基因Bax和caspase3的表达而抑制C2C12细胞的增殖。该结果为骨骼肌中UCP3的功能研究提供基础数据。

关键词： UCP3 C2C12细胞细胞增殖细胞凋亡

基于RNA-Seq技术筛选影响猪肌纤维性状的候选基因

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畜牧兽医学报 2019年第5期50卷 918-929页

作者：成志敏张宁芳王媛媛乐宝玉张万锋宋鹏康郭晓红高鹏飞蔡春波曹果清李步高山西农业大学动物科技学院太谷030801

旨在探究影响肌纤维性状的候选基因和信号通路。本研究以马身猪和大白猪为研究对象,采用HE染色法分析6月龄马身猪和大白猪背最长肌肌纤维直径和密度,利用RNA-Seq分析马身猪和大白猪背最长肌组织中基因表达情况,并对差异表达基因进行GO和... 详细信息

旨在探究影响肌纤维性状的候选基因和信号通路。本研究以马身猪和大白猪为研究对象,采用HE染色法分析6月龄马身猪和大白猪背最长肌肌纤维直径和密度,利用RNA-Seq分析马身猪和大白猪背最长肌组织中基因表达情况,并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,再通过qRT-PCR验证RNA-Seq结果的准确性。结果显示,马身猪背最长肌肌纤维直径极显著低于大白猪(P<0.01),而肌纤维密度极显著高于大白猪(P<0.01)。转录组测序结果显示,在6月龄马身猪和大白猪背最长肌中,差异倍数在2倍以上的基因共105个,其中,马身猪相对于大白猪上调的基因有55个,下调的基因有50个。GO富集分析表明,差异表达基因主要富集在与线粒体相关的细胞组分和骨骼肌分化有关的生物学过程中;KEGG分析结果显示,这些差异表达基因主要参与到与氧化磷酸化有关的信号途径。qRT-PCR和RNA-Seq对6个DEGs表达情况的检测结果表明它们的表达趋势相同,说明RNA-Seq结果准确可靠。结合差异基因表达丰度、GO和KEGG富集分析结果,本研究发现,MYL3、MYH3、MYH6基因通过影响肌纤维的组成而影响肌纤维特性,ND6基因通过参与线粒体氧化磷酸化过程影响肌纤维类型,MICU2基因通过维持线粒体Ca^(2+)浓度的稳态影响细胞功能,编码转录因子的EGR1和FOS基因通过调节细胞增殖、分化和凋亡等过程影响肌肉生长发育。本研究初步揭示了造成马身猪和大白猪肌纤维性状差异的主要原因,为猪肉品质的改善提供了相应的理论依据。

关键词：猪肌纤维性状候选基因 RNA-Seq

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6个猪种FUT1基因的多态性分析

畜牧与兽医 2017年第1期49卷 1-5页

作者：杨青春侯佳浦忠得王泽艺张旗李萌靳玉舒刘宏郭晓红曹果清李步高高鹏飞山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 山西省畜牧遗传育种中心山西太原030027 山西省大同市种猪场山西大同037000

α(1,2)岩藻糖转移酶基因1(α-1,2-Fucosyltransferase gene,FUT1)是可以调节大肠杆菌F18侵染猪小肠、并引起仔猪水肿和腹泻的一个抗性基因。采用PCR-SSCP方法,检测了FUT1基因在大白猪、长白猪、杜洛克、马身猪、山西黑猪、晋汾白猪6个... 详细信息

α(1,2)岩藻糖转移酶基因1(α-1,2-Fucosyltransferase gene,FUT1)是可以调节大肠杆菌F18侵染猪小肠、并引起仔猪水肿和腹泻的一个抗性基因。采用PCR-SSCP方法,检测了FUT1基因在大白猪、长白猪、杜洛克、马身猪、山西黑猪、晋汾白猪6个猪种中的多态性。结果表明:在大白猪、长白猪和杜洛克这3个引进品种中,存在A、B、C 3种单倍型,A单倍型的平均分布频率为0.58;而在地方品种马身猪及其培育品种山西黑猪和晋汾白猪中只发现了单倍型A。经测序比对发现B单倍型第5位碱基发生了C→A的转换,第145个碱基处发生了T→C的突变;而单倍型C的第372位碱基A发生缺失。大白和杜洛克2个种群Hardy-Weinberg不平衡,FUT1基因在国外引进猪种大白、长白、杜洛克种群多态性丰富。

关键词：猪种 FUT1基因多态性 PCR-SSCP