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c-myc和K-ras对小鼠卵巢上皮细胞体外转化和体内致瘤的研究

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中华肿瘤杂志 2006年第12期28卷 881-885页

作者：姚德生李力 Kenneth Garson barbara c.vanderhyden 广西医科大学肿瘤医院妇瘤科南宁530021 加拿大渥太华大学癌症中心

目的探讨癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用。方法用逆转录病毒转基因系统,将正常的c-myc基因和突变的K-ras基因先后导入小鼠卵巢上皮(MOSE)细胞,建立表达c-myc和K-ras基因的细胞株,分别称为MOSE-Myc细胞、MOSE-Ras细胞和MOSE... 详细信息

目的探讨癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用。方法用逆转录病毒转基因系统,将正常的c-myc基因和突变的K-ras基因先后导入小鼠卵巢上皮(MOSE)细胞,建立表达c-myc和K-ras基因的细胞株,分别称为MOSE-Myc细胞、MOSE-Ras细胞和MOSE-RM细胞。通过细胞增殖实验、克隆形成实验、体外侵袭实验以及体内成瘤实验,研究转基因后MOSE细胞生物学特性的改变及恶性转化。结果c-myc和K-ras基因容易被重组逆转录病毒导入MOSE细胞,转导后靶细胞内分别有相应的c-myc或K-ras mRNA转录,以及相应的c-myc(62 000)和K-ras(21 000)蛋白的表达。MOSE-Ras组和MOSE-RM(MOSE-Ras／Myc)组细胞增殖能力显著强于MOSE和MOSE-Myc组(Pc组(Pc组不能形成克隆集落。MOSE-Ras组和MOSE-RM组能够穿透Matrigel,具有侵袭能力。MOSE-Ras组和MOSE-RM组细胞在裸鼠体内形成肿瘤,且肿瘤组织细胞仍然可见有K-ras和c-myc蛋白的表达;而MOSE组和MOSE-Myc组无肿瘤形成。结论重组逆转录病毒载体作为转基因的工具,转导效率高,可稳定表达,可以感染正常的细胞;突变的K-ras可使MOSE发生恶性转化,在体内形成肿瘤;c-myc作为一个核转录调节因子,不能使MOSE发生恶性转化,但可协同其他因子,加强其他因子的功能。

关键词：逆转录病毒载体卵巢肿瘤 K-ras c—myc 基因转移移植瘤模型

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携带OPcML基因的慢病毒表达质粒的构建

现代妇产科进展 2006年第7期15卷 518-521,i0001页

作者：姚德生李力 Kenneth Garson barbara c.vanderhyden 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科南宁530021 加拿大渥太华大学癌症中心

目的:建立携带和表达OPcML基因的慢病毒(lentiviral viruses,LV)表达质粒。方法:用内切酶将OPcML基因从已构建的表达质粒pcDNA3-OPcML上切下,插入慢病毒载体pWPI-GFP中,构建慢病毒表达质粒pWPI-OPcML,通过酶切、测序和检测验证OPcML蛋白... 详细信息

目的:建立携带和表达OPcML基因的慢病毒(lentiviral viruses,LV)表达质粒。方法:用内切酶将OPcML基因从已构建的表达质粒pcDNA3-OPcML上切下,插入慢病毒载体pWPI-GFP中,构建慢病毒表达质粒pWPI-OPcML,通过酶切、测序和检测验证OPcML蛋白后,将pWPI-OPcML、pcMV-dR8.74和pMDG共转染包装细胞293T,获得重组慢病毒,再感染靶细胞A2780,通过检测标志蛋白-绿色荧光蛋白(GFP)和目的蛋白OPcML进一步验证pWPI-OPcML在细胞中OPcML的表达。结果:(1)pWPI-OPcML中携有正确的OPcML基因,并能在人类细胞中表达;(2)pWPI-OPcML共转染包装细胞293T能产生重组病毒;(3)目的基因OPcML能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞A2780,并达到稳定的表达,转导效率几乎达100%,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到OPcML和GFP蛋白在靶细胞中的表达。结论:pWPI-OPcML能在人细胞中表达OPcML蛋白,共转染包装细胞获得的重组慢病毒能感染人细胞,作为转基因的工具,具有高效性。

关键词：基因 OPcML 卵巢肿瘤慢病毒载体基因转移

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OPcML基因的克隆

广西医科大学学报 2006年第2期23卷 220-222页

作者：姚德生李力 Kenneth Garson barbara c.vanderhyden 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科南宁530021 加拿大渥太华大学癌症中心

目的:建立OPcML真核细胞表达质粒。方法:利用计算机软件Vector NTI,根据GenBank中OPcML的序列,用RT-PcR法从小鼠大脑组织中扩增OPcML基因全长片段,将其克隆入真核细胞表达质粒pcDNA3,建立OPcML的表达质粒pcDNA3-OPcML,后将其转染入人胚... 详细信息

目的:建立OPcML真核细胞表达质粒。方法:利用计算机软件Vector NTI,根据GenBank中OPcML的序列,用RT-PcR法从小鼠大脑组织中扩增OPcML基因全长片段,将其克隆入真核细胞表达质粒pcDNA3,建立OPcML的表达质粒pcDNA3-OPcML,后将其转染入人胚胎肾细胞(293T),用Western blot检测OPcML蛋白在293T中的表达。结果:OPcML能被成功地从正常组织中克隆,构建了真核细胞表达质粒pcDNA3-OPcML,测序表明其携带有正常OPcML的全长序列;转导入人类细胞后有OPcML蛋白的高量表达。结论:pcDNA3-OPcML携带有正常的OPcML全长基因序列,其能在真核细胞中高量表达功能蛋白。

关键词： OPcML基因转移质粒

癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用

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广西医科大学学报 2006年第3期23卷 371-374页

作者：姚德生李力 Kenneth Garson barbara c. vanderhyden 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科南宁530021 加拿大渥太华大学癌症中心

目的:探讨癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用。方法:用Moloney逆转录病毒载体先后将正常的c-myc基因和突变的K-ras基因转导入小鼠正常卵巢上皮细胞(MOSE),建立表达c-myc或(和)K-ras基因的细胞系,分别称为Myc细胞、Ras细胞、R... 详细信息

目的:探讨癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用。方法:用Moloney逆转录病毒载体先后将正常的c-myc基因和突变的K-ras基因转导入小鼠正常卵巢上皮细胞(MOSE),建立表达c-myc或(和)K-ras基因的细胞系,分别称为Myc细胞、Ras细胞、RM细胞,通过细胞增殖试验、裸鼠体内成瘤试验研究转基因后MOSE细胞生物学特性的改变。结果:用携带有c-myc和K-ras基因的重组逆转录病毒感染MOSE后,用RT-PcR和Westernblot能分别检测到有相应的c-myc或(和)K-rasmRNA转录以及蛋白的表达;Ras细胞增殖显著快于MOSE和Myc细胞(Pc细胞(Pc-myc蛋白的表达;MOSE细胞和Myc细胞没有肿瘤形成。结论:重组逆转录病毒载体具有高转导效率,突变的K-ras可使MOSE发生恶性转化,在体内形成肿瘤;c-myc不能使MOSE发生恶性转化,但具有协同作用。

关键词：逆转录病毒载体卵巢癌 K-ras c-myc基因转移

c-myc和K-ras对小鼠卵巢上皮细胞体外转化和体内致瘤的研究

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c-myc和K-ras对小鼠卵巢上皮细胞体外转化和体内致瘤的研究

中华医学会第九次全国妇科肿瘤学术会议

作者：姚德生李力 Kenneth Garson barbara c.vanderhyden 广西医科大学肿瘤医院妇瘤科加拿大渥太华大学癌症中心

研究卵巢癌的发病机理和建立动物模型,加深对卵巢癌的认识,有助于寻找更有效的治疗方法。 ras是第一个被鉴定的人类癌基因,H-ras、K-ras和N-ras是ras基因家族中与人类肿瘤最为密切的基因,点突变在人类肿瘤中有极高的检出率,K-ras在卵巢...

研究卵巢癌的发病机理和建立动物模型,加深对卵巢癌的认识,有助于寻找更有效的治疗方法。 ras是第一个被鉴定的人类癌基因,H-ras、K-ras和N-ras是ras基因家族中与人类肿瘤最为密切的基因,点突变在人类肿瘤中有极高的检出率,K-ras在卵巢癌检出率可高达71．4％。c-myc属于Myc家族的原癌基因,在基因转录的过程中起着重要的调控作用,过度扩增和序列的重排在人类肿瘤当中常被

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永生化正常小鼠卵巢上皮细胞系的建立

永生化正常小鼠卵巢上皮细胞系的建立

中华医学会第九次全国妇科肿瘤学术会议

作者：姚德生李力 Kenneth Garson barbara c.vanderhyden 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科加拿大渥太华大学癌症中心

目的:探讨具有“永生化”特性的正常小鼠卵巢上皮细胞(MOSE)系建立的方法和可行性。方法: 用胰酶消化法从温度敏感抗原(TsAg)转基因小鼠中分离MOSE,用4％血清培养液培养,通过细胞形态学特征的观察、细胞免疫组织化学染色检测cK-19和Vime...

目的:探讨具有“永生化”特性的正常小鼠卵巢上皮细胞(MOSE)系建立的方法和可行性。方法: 用胰酶消化法从温度敏感抗原(TsAg)转基因小鼠中分离MOSE,用4％血清培养液培养,通过细胞形态学特征的观察、细胞免疫组织化学染色检测cK-19和Vimentin来鉴别,体内成瘤实验观察有否恶性转化。结果:用胰酶消化法能迅速获得足够的MOSE,低血清(4％)培养可以有效去除可能污染的间

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重组慢病毒介导的OPcML基因的体外转染及其对卵巢上皮性癌细胞的抑制作用

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重组慢病毒介导的OPCML基因的体外转染及其对卵巢上皮性癌细胞的...

第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议

作者：姚德生李力 Kenneth Garson barbara c.vanderhyden 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科加拿大渥太华大学癌症中心加拿大渥太华大学癌症中心

目的:探讨重组慢病毒介导的体外转导OPcML基因的可行性及其对卯巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的抑制作用。方法:采用PcR技术,用基因特异性引物将OPcML基因的cDNA从cD1小鼠脯组织中扩增,并将OPcML基因克隆到慢病毒载体表达质粒pWPI-GFP上,构... 详细信息

目的:探讨重组慢病毒介导的体外转导OPcML基因的可行性及其对卯巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的抑制作用。方法:采用PcR技术,用基因特异性引物将OPcML基因的cDNA从cD1小鼠脯组织中扩增,并将OPcML基因克隆到慢病毒载体表达质粒pWPI-GFP上,构建慢病毒载体表达质粒pWPI—OPcML;将pWPI—OPcML或pWPI—GFP （空载体对照）质粒和包装质粒pcMVdR8．74+pMDG共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带OPcML和绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组慢病毒WPI-OPcML或仅携带GFP基因的重组慢病毒WPI—GFP;用重组慢病毒 WPI-OPcML和WPI-GFP分别转导靶细胞,即人卵巢癌细胞系A2780、Occ1细胞和小鼠正常卵巢上皮细胞系cD1 细胞,以未转染任何基因者为空白对照。通过细胞增殖实验、细胞聚合力实验、细胞周期分析和体内成瘤实验观察 OPcML基因对卵巢癌细胞的抑制作用。结果:（1）OPcML 基因能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞,转导效率几乎达 100％,并稳定表达,蛋白印迹法检测显示,靶细胞中OPcML 和GFP蛋白均有表达。（2）细胞增殖实验显示,A2780细胞中,转导OPcML基因72 h后的细胞（即A2780／OPcML 细胞）数为（7．6±1．0）×105个,明显少于未转导基因（即 A2780）或仅转导空载体（即A2780／pWPI）的细胞[分别为（20．0±2．6）×105和（1 8．1±1．7）×105个;P＜0．01],但 Occ1和cD1细胞中,OPcML基因对细胞的增殖无明显的影响（P＞0．05）;（3）细胞周期分析显示,OPcML基因对 A2780细胞的细胞周期有明显的阻滞作用（转导前、后分别为67％、75％,P＜0．05）,但对Occ1、cD1细胞则无明显阻滞作用（P＞0．05）;（4）细胞聚合力实验显示,与空载体对照相比,OPcML基因能明显增强细胞的黏附力（P＜ 0．05）;（5）移植瘤实验显示,将A2780／OPcML细胞注射到裸鼠皮下,4只裸鼠中仅1只裸鼠有肿瘤生长,其肿瘤重量为10 mg,显著低于注射A2780、A2780／pWPI细胞的裸鼠[4 只裸鼠均有肿瘤生长,其肿瘤重量分别为（280±53）及（677±323）mg;P＜0．01]。免疫组化法检测显示,肿瘤组织中OPcML蛋白有表达。结论:用重组的慢病毒载体作为转基因的工具,具有高效性,同时能使目的基因达到持续稳定的表达。OPcML基因能够增加A2780细胞的黏附能力, 抑制A2780细胞的增殖和体内成瘤,提示OPcML基因可能是一个新的抑癌基因。

关键词：慢病毒载体卵巢癌 OPcML 基因转移移植瘤模型

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OPcML基因的克隆

OPCML基因的克隆

中华医学会第九次全国妇科肿瘤学术会议

作者：姚德生李力 Kenneth Garson barbara c.vanderhyden 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科加拿大渥太华大学癌症中心

目的:建立OPcML真核细胞表达质粒。方法:利用计算机软件Vector NTI,根据GenBank中 OPcML的序列,用RT-PcR法从小鼠大脑组织中扩增OPcML基因全长片段,后将其克隆入真核细胞表达质粒pcDNA3,建立OPcML的表达质粒pcDNA3-OPcML,后将其转导入...

目的:建立OPcML真核细胞表达质粒。方法:利用计算机软件Vector NTI,根据GenBank中 OPcML的序列,用RT-PcR法从小鼠大脑组织中扩增OPcML基因全长片段,后将其克隆入真核细胞表达质粒pcDNA3,建立OPcML的表达质粒pcDNA3-OPcML,后将其转导入人肾胚胎细胞(293T),用

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逆转录病毒介导c-myc和K-ras的转基因卵巢癌小鼠模型的建立

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逆转录病毒介导c-myc和K-ras的转基因卵巢癌小鼠模型的建立

第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议

目的:为了探讨癌基因c—myc和K—ras在卵巢癌发生发展中的作用,以及重组Moloney逆转录病毒作为基因转移的载体的可行性和优点。方法:分离收集cD1小鼠卵巢上皮细胞（MOSE）,进行原代培养,建立了MOSE细胞株,将正常的c—myc基因和突变的K—... 详细信息

目的:为了探讨癌基因c—myc和K—ras在卵巢癌发生发展中的作用,以及重组Moloney逆转录病毒作为基因转移的载体的可行性和优点。方法:分离收集cD1小鼠卵巢上皮细胞（MOSE）,进行原代培养,建立了MOSE细胞株,将正常的c—myc基因和突变的K—ras基因用Moloney逆转录病毒载体先后转导入MOSE,建立表达c—myc基因和／或 K—ras的细胞系,分别称为Ras细胞、Myc细胞、RM细胞株。我们通过细胞增殖试验、软琼脂克隆形成试验、Matrigel 体外侵袭试验以及裸鼠体内成瘤试验研究转基因后MOSE细胞生物学特性的改变和恶性转化。结果:用携带有c-myc和 K-ras基因的重组逆转录病毒感染MOSE后,用RT-PcR 能够检测到在靶细胞内分别有相应的c—myc或／和K—ras mRNA转录,Western blot能够检测到相应的c—myc （62kDa）或／和K—ras（21kDa）蛋白的表达;细胞增殖实验显示,转导了K—ras的的MOSE细胞（Ras组和RM组）增殖显著快干未转基因的MOSE和Myc（单独c—myc）组（P＜ 0．01）,RM组细胞显著快于Myc组（P＜0．05）;软琼脂克隆形成试验显示Ras和RM组在软琼脂培养中均能形成克隆集落,而MOSE组和Myc组却不能形成克隆集落;Matrigel 体外侵袭试验显示Ras和RM组能够穿透Matrigel,具有侵袭能力,而MOSE组和Myc组细胞不能穿过Matrigel,不具有侵袭能力;异体移植瘤试验显示,将Ras和RM组细胞腹腔注射于裸鼠体内,有肿瘤形成,而MOSE组和Myc组没有肿瘤形成;免疫组化染色显示,虽然经过长时间体外的生长,形成的肿瘤组织细胞仍然可见有K—ras和c—myc蛋白的表达。结论:重组的Moloney逆转录病毒载体作为转基因的工具,具有高转导效率,可以感染正常的细胞,同时能将目的基因整合到宿主细胞的基因组中,达到稳定表达, 其表达的蛋白质在异体移植瘤的组织中仍然有稳定表达;突变的K—ras可使MOSE发生恶性转化,在体内形成肿瘤;c—myc作为一个核转录调节因子,单独不能使细胞增殖加快,也不能使MOSE发生恶性转化,在体内也不能形成肿瘤,但可协同其他因子如K—ras,加强其功能,赋予细胞更强的生长和侵袭能力。

关键词：逆转录病毒载体卵巢癌 K-ras c-myc 基因转移移植瘤模型