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Combined insertion of basic and non-basic amino acids at hemagglutinin cleavage site of highly pathogenic H7N9 virus promotes replication and pathogenicity in chickens and mice

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Virologica Sinica 2022年第1期37卷 38-47页

作者： Aobaixue Zhou Jiahao Zhang Huanan Li Qiang Xu Yiqun Chen Bo Li Wanying Liu Guanming Su Xingxing Ren Guangjie Lao baozheng luo Ming Liao Wenbao Qi College of Veterinary Medicine South China Agricultural UniversityGuangzhou510642China National Avian Infiuenza Para-reference Laboratory South China Agricultural UniversityGuangzhou510642China Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture Guangzhou510642China Gongbei Customs Technology Center Zhuhai519000China National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonoses Prevention and Control Guangzhou510642China Key Laboratory of Zoonoses Ministry of AgricultureGuangzhou510642China Key Laboratory of Animal Vaccine Development Ministry of AgricultureGuangzhou510642China Key Laboratory of Zoonoses Prevention and Control of Guangdong Province Guangzhou510642China

Since mid-2016,the low pathogenic H7N9 influenza virus has evolved into a highly pathogenic(HP)phenotype in China,raising many concerns about public health and poultry *** insertion of a“KRTA”motif at hemagglutinin cleavage site(HACS)occurred in the early stage of HP H7N9 *** the co-circulation,the HACS of HP-H7N9 variants were more polymorphic in birds and *** HP-H7N9 variants,unlike the H5 subtype virus,exhibited the insertions of basic and non-basic amino acids,the underlying function of those insertions and substitutions remains *** results of bioinformatics analysis indicated that the PEVPKRKRTAR/G motif of HACS had become the dominant motif in ***,we generated six H7N9 viruses bearing the PEIPKGR/G,PEVPKGR/G,PEVPKRKRTAR/G,PEVPKGKRTAR/G,PEVPKGKRIAR/G,and PEVPKRKRR/G ***,after the deletion of threonine and alanine(TA)at HACS,the H7N9 viruses manifested decreased thermostability and virulence in mice,and the PEVPKRKRTAR/G-motif virus is prevalent in birds and humans probably due to its increased transmissibility and moderate *** contrast,the insertion of non-basic amino acid isoleucine and alanine(IA)decreased the transmissibility in chickens and virulence in ***,the I335V substitution of H7N9 virus enhanced infectivity and transmission in chickens,suggesting that the combination of mutations and insertions of amino acids at the HACS promoted replication and pathogenicity in chickens and *** ongoing evolution of H7N9 increasingly threatens public health and poultry industry,so,its comprehensive surveillance and prevention of H7N9 viruses should be pursued.

关键词： H7N9 Highly pathogenic Cleavage site Basic and non-basic amino acids Pathogenicity

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传染性皮下和造血器官坏死病毒RPA与CRISPRCas12a可视化快速检测方法的建立

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中国兽医科学 2024年第5期54卷 595-601页

作者：周傲白雪徐博文沙才华邵建宏赵福振廖秀云黄海超蒋晓霞罗宝正陈轩拱北海关技术中心广东珠海519015

根据传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)基因序列的保守区域设计并合成多组RPA引物和特异性crRNA,经过筛选与优化,建立RPA-Cas12a系统荧光检测法和试纸条法2种可视化快速检测IHHNV的方法。结果显示,这2种可视化检测方法在37℃恒温反应... 详细信息

根据传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)基因序列的保守区域设计并合成多组RPA引物和特异性crRNA,经过筛选与优化,建立RPA-Cas12a系统荧光检测法和试纸条法2种可视化快速检测IHHNV的方法。结果显示,这2种可视化检测方法在37℃恒温反应40 min可检测出IHHNV;与对虾白斑综合征病毒、虾肝肠胞虫和十足目虹彩病毒1无交叉反应;该方法灵敏度较高,最低检测浓度为10 copies/μL;应用该方法对10份IHHNV阳性临床样本进行检测,阳性检出率为100%。综合结果表明,建立的荧光法和试纸条2种可视化检测IHHNV的方法操作简单,反应灵敏,适用于对虾养殖场或基层实验室对IHHNV的定期监测和初筛。

关键词：传染性皮下和造血器官坏死病毒重组酶聚合酶扩增 CRISPR-Cas12a 检测方法

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非洲猪瘟病毒的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法的建立

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黑龙江畜牧兽医 2023年第14期 86-90,137-139页

作者：徐博文周傲白雪林志达梁基壮罗宝正拱北海关技术中心广东珠海519015 珠海市斗门区基壮农业发展有限公司广东珠海519100

为了建立一种特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(ASFV)快速检测方法,试验针对ASFV B646基因保守片段设计并合成特异性crRNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3),并根据crRNA所在的基因序列区域设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物(RPA1-F/RPA1-R、RPA2F... 详细信息

为了建立一种特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(ASFV)快速检测方法,试验针对ASFV B646基因保守片段设计并合成特异性crRNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3),并根据crRNA所在的基因序列区域设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物(RPA1-F/RPA1-R、RPA2F/RPA2-R),通过筛选最佳RPA引物-crRNA序列组合和crRNA浓度建立ASFV的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法,在评估该方法的特异性和灵敏度后对ASFV阳性临床样本进行验证。结果表明:最佳RPA引物-crRNA序列组合为RPA2-crRNA3,最佳crRNA浓度为5μmol/L;该方法仅能检测出ASFV,不能检测出猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2),特异性良好;最低检测病毒浓度为5.8 copies/μL,灵敏度较高;应用该方法对20份ASFV阳性临床样本进行检测,结果均为阳性,符合率为100%。说明成功建立了ASFV的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法,该方法特异性好、灵敏度高,可用于ASFV的现场快速检测。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) 重组酶聚合酶扩增(RPA) CRISPR-Cas12a系统快速检测方法建立

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牛传染性胸膜肺炎研究进展

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广东畜牧兽医科技 2023年第4期48卷 48-53页

作者：徐博文邵建宏王永刚陈德镁罗宝正中华人民共和国拱北海关技术中心广东珠海519000 中华人民共和国沈阳海关辽宁沈阳110000 中华人民共和国拱北海关广东珠海519000

牛传染性胸膜肺炎是由丝状支原体亚种引起的严重牛科动物传染性疾病,是WO-AH规定必须报道的重要传染病之一,属我国一类动物疫病。该病于20世纪初传入我国并在我国多个地区暴发流行,导致大量牛只死亡,相关产品的出口贸易受到严重影响,经... 详细信息

牛传染性胸膜肺炎是由丝状支原体亚种引起的严重牛科动物传染性疾病,是WO-AH规定必须报道的重要传染病之一,属我国一类动物疫病。该病于20世纪初传入我国并在我国多个地区暴发流行,导致大量牛只死亡,相关产品的出口贸易受到严重影响,经济损失惨重。1996年我国宣布消灭该疾病,但直至2011年才获WOAH认可为无CBPP国家。目前该病在非洲、拉丁美洲等地区频发,严重影响当地农牧业发展,造成巨大经济损失;近年来该病在我国周边国家仍有报道,具有再次传入我国的风险。我国对牛传染性胸膜肺炎的研究分析工作与国外相比较晚、较少,该文结合国内外的研究进展,从牛传染性胸膜肺炎的病原学特征、流行病学特点、致病机制、临床特征、检测与诊断等方面进行系统阐述,并结合疫病发病机理和流行特点提出了防控建议,以期为我国牛传染性胸膜肺炎的深入研究、监测防控及预警提供参考。

关键词：牛牛传染性胸膜肺炎牛肺疫 CBPP 病原学流行病学疾病防控

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基于16S rRNA基因对濒危脊椎动物鉴定的可行性

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野生动物学报 2022年第1期43卷 51-57页

作者：蒋晓霞徐博文李伟刚邵建宏周傲白雪唐泰山赵福振苗丽黄海超罗宝正拱北海关技术中心珠海519001 南京海关动植物与食品检测中心南京210019 郑州海关技术中心郑州450003

为探索16S rRNA基因条形码技术在濒危脊椎动物物种鉴定中的可行性,选取脊椎动物线粒体16S rRNA基因中长度为286 bp的片段设计通用引物,以哺乳纲(Mammalia)、爬行纲(Reptilia)、两栖纲(Amphibia)、软骨鱼纲(Chondrichthyes)和辐鳍鱼纲(Ac... 详细信息

为探索16S rRNA基因条形码技术在濒危脊椎动物物种鉴定中的可行性,选取脊椎动物线粒体16S rRNA基因中长度为286 bp的片段设计通用引物,以哺乳纲(Mammalia)、爬行纲(Reptilia)、两栖纲(Amphibia)、软骨鱼纲(Chondrichthyes)和辐鳍鱼纲(Actinopterygii)中24科、28属、40种共71个濒危脊椎动物样本为研究对象,进行PCR扩增并对扩增产物进行纯化、测序和基因序列分析。结果显示:建立的检测方法灵敏度可以达0.001 ng/μL,其中62个(39个物种)样本扩增成功,57个样本(34个物种)测序结果与GenBank数据库中的参考序列具有较高相似度,可以鉴定到种的水平。测序所得的基因序列与参考序列的种内遗传距离为0~0.5%、种间遗传距离为1.0%~39.9%,最小种间遗传距离大于最大种内遗传距离,即存在明显的条形码间隔;另外5个样本(5个物种)测序结果在属内种间高度一致,只能鉴定到属的水平。基于16S rRNA基因片段构建的条形码可对濒危脊椎动物进行种属鉴定,可为濒危物种保护、打击非法走私等提供技术支撑。

关键词：濒危脊椎动物 16S rRNA 种属鉴定

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亚洲穿山甲实时荧光PCR鉴定方法的研究

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经济动物学报 2022年第1期26卷 23-28页

作者：邵建宏蒋晓霞徐博文严展翘孔凡德苗丽陈轩罗宝正拱北海关技术中心厦门海关技术中心郑州海关技术中心

受利益驱使，人类长期大量捕杀穿山甲并走私至中国用作食材和药材，导致穿山甲的数量急剧下降，仅存的4种亚洲穿山甲均被列为极危或濒危野生动物。为切实加强野生动物保护，有效打击走私犯罪活动，本研究基于8种现存穿山甲线粒体Cyt b... 详细信息

受利益驱使，人类长期大量捕杀穿山甲并走私至中国用作食材和药材，导致穿山甲的数量急剧下降，仅存的4种亚洲穿山甲均被列为极危或濒危野生动物。为切实加强野生动物保护，有效打击走私犯罪活动，本研究基于8种现存穿山甲线粒体Cyt b基因序列设计一组通用型引物、探针，建立亚洲穿山甲的鉴定方法；使用荧光PCR法对现有亚洲穿山甲样本及相关比对样本进行DNA扩增，从特异性、灵敏度、稳定性等方面对建立的方法进行验证和优化。结果表明：所建立的鉴定方法能够准确识别亚洲穿山甲源性成分。

关键词：穿山甲鳞片实时荧光PCR 源性成分

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多重实时RT-PCR快速检测新型甲型H1N1流感病毒

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农业生物技术学报 2010年第2期18卷 352-355页

作者：潘朝思罗宝正薄清如莫秋华徐海聂沙才华廖秀云珠海出入境检验检疫局国家外来病检测重点实验室

从GenBank中获取新型甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)HA和NA基因序列,通过多重序列比对之后,设计合成H1和N1基因特异性的引物和探针,用来建立新的甲型H1N1亚型流感病毒的多重实时RT-PCR检测方法。合成的两条荧光探针分别标记FAM和CY5荧... 详细信息

从GenBank中获取新型甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)HA和NA基因序列,通过多重序列比对之后,设计合成H1和N1基因特异性的引物和探针,用来建立新的甲型H1N1亚型流感病毒的多重实时RT-PCR检测方法。合成的两条荧光探针分别标记FAM和CY5荧光报告基团,荧光淬灭均使用BHQ基团。多重实时RT-PCR实验在ABI7500实时PCR仪上进行,经过40个循环的扩增之后,阳性对照出现标准的S型曲线,并且具有良好的特异性,可以很好地将新的甲型H1N1与传统的甲型H1N1以及H3N2、H5N1、H6N2和H9N2等流感病毒区分。多重实时RT-PCR可以检测到10个拷贝的模板,灵敏度接近检测方法的极限。检测时间短,从加样到反应结束只需要90min。在对243例发热病人临床样品检测过程中发现7例阳性,1351份猪临床样品检测中未发现阳性,该检测结果和采用中国检验检疫科学研究院研制的试剂盒获得的检测结果一致。本研究所建立的快速、准确和高敏感性的多重实时RT-PCR方法非常适用于新型甲型H1N1流感病毒的实验室筛查。

关键词：甲型流感病毒 H1N1亚型多重实时RT-PCR

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小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测方法的建立

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病毒学报 2017年第6期33卷 886-891页

作者：李儒曙苏惠龙罗宝正赵福振薄清如邵建宏邓湘辉黄铮珠海市动物卫生监督所珠海519001 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心珠海519015

为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝... 详细信息

为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒的方法。实验结果表明,该方法特异性好、灵敏度高,检测最低浓度为10拷贝/μL数量级阳性标准品。通过对临床样品的检测,证实本研究建立的检测方法具有较好的临床应用价值。

关键词：小反刍兽疫病毒(PPRV) 蓝舌病病毒(BTV) 双重荧光RT-PCR

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犀牛源性成分PCR检测方法的建立

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野生动物学报 2016年第4期37卷 316-320页

作者：邵建宏赵福振罗宝正薄清如沙才华廖秀云徐海聂珠海出入境检验检疫局国家外来病检测重点实验室珠海519015

为了对犀牛源性成分进行有效鉴定,根据犀科(Rhinocerotidae)动物线粒体DNA(mitochondrial DNA)序列,使用分子生物学软件Oligo 7.0设计了特异性引物,用来建立PCR检测犀牛源性成分的方法。结果显示,建立的PCR方法可以对犀牛阳性样品进行扩... 详细信息

为了对犀牛源性成分进行有效鉴定,根据犀科(Rhinocerotidae)动物线粒体DNA(mitochondrial DNA)序列,使用分子生物学软件Oligo 7.0设计了特异性引物,用来建立PCR检测犀牛源性成分的方法。结果显示,建立的PCR方法可以对犀牛阳性样品进行扩增,凝胶电泳呈现特异性条带。方法特异性好,13份其他物种的样品均为阴性结果。方法灵敏度较高,可检测到100拷贝重组质粒DNA模板。对5份送检样品检测发现2份犀牛样品,与测序结果一致。结果表明,新建立的方法可应用于样品中犀牛源性成分的检测。

关键词：犀牛源性成分 PCR 检测

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EHP、SHIV双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的构建及应用

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中国动物传染病学报 2022年第1期30卷 112-119页

作者：侯月娥曾俊霞蓝间媛许枣珠廖秀云罗宝正珠海科艺普检测科技有限公司珠海51900 拱北海关技术中心珠海519015

本研究根据GenBank中已有的虾肝肠胞虫(EHP)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)基因的保守序列,设计特异的引物和探针。建立了快速诊断EHP和SHIV的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和稳定性进行检测。结果表明:该方法检... 详细信息

本研究根据GenBank中已有的虾肝肠胞虫(EHP)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)基因的保守序列,设计特异的引物和探针。建立了快速诊断EHP和SHIV的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和稳定性进行检测。结果表明:该方法检测限可达10 copies/μL,其敏感性是SYBR Green real-time PCR的10倍,普通PCR法的100倍;对白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、高致病性副溶血弧菌,以及桃拉综合征病毒的检测结果均为阴性,表明无交叉反应,具有良好特异性;重复性试验结果表明,该方法Ct值的变异系数小于4%,具有良好的稳定性。对37份已知检测结果的样品进行检测,结果符合率为100%。本研究建立的EHP和SHIV检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对虾隐性感染的早期监测。

关键词：虾肝肠胞虫虾血细胞虹彩病毒 TaqMan荧光定量PCR

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