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H9N2亚型禽流感病毒ns1基因的融合表达

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华南农业大学学报 2006年第2期27卷 92-95页

作者：陈丽谢青梅李少璃王敬师马静云毕英佐曹永长华南农业大学动物科学学院广东广州510642

禽流感病毒(AIV)非结构蛋白NS1在病毒粒子中不存在,因此,可以通过检测NS1抗体来鉴别禽流感病毒感染鸡群和免疫鸡群.将ns1基因和T4噬菌体soc基因在大肠埃希氏菌中融合表达,融合蛋白可以作为鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群的检测抗原.采用R... 详细信息

禽流感病毒(AIV)非结构蛋白NS1在病毒粒子中不存在,因此,可以通过检测NS1抗体来鉴别禽流感病毒感染鸡群和免疫鸡群.将ns1基因和T4噬菌体soc基因在大肠埃希氏菌中融合表达,融合蛋白可以作为鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群的检测抗原.采用RT-PCR方法扩增禽流感病毒H9N2的ns1基因(654 bp);将该片段克隆至pSOC质粒soc基因3′端,成功构建了重组质粒pSOC-NS1,用该重组质粒转化*** l21(DE3)感受态细胞,以终浓度1 mmol/mL的IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果表明pSOC-NS1融合蛋白相对分子质量约39 000.W estern-b lot证实,表达产物与AIV H9N2病毒感染的小鼠血清具有良好的反应性.

关键词：禽流感病毒 ns1基因 soc基因

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鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达

广东农业科学 2009年第3期36卷 123-126页

作者：张辉华杨小梅谢青梅马静云曹永长毕英佐佛山科学技术学院生命科学学院广东佛山528231 华南农业大学动物科学学院广东广州510642 中山大学生命科学学院广东广州510275

对鸡β-防御素-3(Gal-3)在毕赤酵母中的分泌表达进行了研究。以重组质粒Gal-3-T为模板,利用PCR技术扩增出Gal-3基因成熟肽片段,将该片段插入到酵母表达载体pPICZα-C,构建分泌型重组表达载体pPICZα-C-Gal-3,电转入表达宿主菌X-33毕赤酵... 详细信息

对鸡β-防御素-3(Gal-3)在毕赤酵母中的分泌表达进行了研究。以重组质粒Gal-3-T为模板,利用PCR技术扩增出Gal-3基因成熟肽片段,将该片段插入到酵母表达载体pPICZα-C,构建分泌型重组表达载体pPICZα-C-Gal-3,电转入表达宿主菌X-33毕赤酵母,Zeocin抗性筛选重组菌株;挑取阳性菌株经甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4.5 kDa位置出现预期条带;对所表达的Gal-3进行抗菌活性检测,发现其具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌的活性。

关键词：鸡β-防御素-3(Gallinacin-3) 毕赤酵母分泌表达

高致病性PRRSV的分离及其Nsp2和ORF5基因的序列分析

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中国兽医科学 2008年第8期38卷 650-657页

作者：马静云李浩波王玲玲何晓明王连想谢青梅毕英佐华南农业大学动物科学学院广东广州510642

从广东省不同地区疑似高致病性猪生殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc-145细胞病变的病毒，经RT-PCR检测，确定分离物中存在美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将此细胞病毒液命名为GDBl，用其感染回归5头40日龄健康仔猪，采... 详细信息

从广东省不同地区疑似高致病性猪生殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc-145细胞病变的病毒，经RT-PCR检测，确定分离物中存在美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将此细胞病毒液命名为GDBl，用其感染回归5头40日龄健康仔猪，采集发病及死亡猪组织，重新用Marc-145细胞进行病毒分离，将再次分离到的病毒命名为GDB1F。对GDB1、GDbiF的Nsp2、ORF5基因序列进行测定分析。结果表明，单独感染猪2／2发病死亡，同居感染的3头猪全部发病，2头死亡；感染后2～4d所有感染猪均出现体温升高。死亡猪表现为严重的出血性、间质性肺炎，肢体远端皮表出血。序列分析结果表明，GDB1和GDB1F株的Nsp2基因与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HN2Nsp2、HNXT1、HNyz、HUB2、HUN1的同源性很高，达98．4％～99．0％。GDB1和GDB1F株的ORF5基因存在部分突变，没有缺失，与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HUB2、JX0612、GDZC1的同源性高达97．5％～99．8％。

关键词：高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒分离 Nsp2基因 ORF5基因序列分析

口蹄疫病毒3B基因的高效表达及其表达产物的反应活性

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中国兽医科学 2007年第10期37卷 867-872页

作者：覃健萍徐维加陈峰马静云谢青梅刘盛梅曹永长毕英佐华南农业大学动物科学学院云南出入境检验检疫局云南昆明650228

通过PCR技术获得口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因,将其克隆至质粒pET-32a(+)和高效可溶性表达质粒pEM中,经PCR筛选,获得阳性重组子pET-3B和pEM-3B,将它们转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot检测结果证明,表达的3B融合... 详细信息

通过PCR技术获得口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因,将其克隆至质粒pET-32a(+)和高效可溶性表达质粒pEM中,经PCR筛选,获得阳性重组子pET-3B和pEM-3B,将它们转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot检测结果证明,表达的3B融合蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应。蛋白可溶性分析表明,EM-3B融合蛋白绝大部分以可溶形式表达。以此可溶性融合蛋白EM-3B为抗原建立了可区分FMD免疫动物和感染动物的EM-3B-DIVA-ELISA方法,经检测,其特异性为95.0%,敏感性为97.5%,与2个国产试剂盒的符合率分别为96.25%和98.75%。

关键词：口蹄疫病毒 3B基因高效可溶性表达鉴别诊断ELISA

FMDV免疫活性串联片段FB与T4噬菌体SOC基因的融合表达

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中国兽医杂志 2006年第5期42卷 3-6页

作者：马静云刘忆云曹永长陈晓春谢青梅毕英佐华南农业大学动物科学学院基因工程实验室广东广州510642

将FM DV免疫活性串联片段FB的cDNA片段插入表达质粒pSOC的E coRⅠ位点,获得重组质粒pSOC-FB。用pSOC-FB转化*** BL 21(DE 3),获得表达FB蛋白的工程菌BL-SOC-FB。在1μg/m l IPTG诱导之下,BL-SOC-FB表达了融合蛋白SOC-FB,其分子量为19 ku... 详细信息

将FM DV免疫活性串联片段FB的cDNA片段插入表达质粒pSOC的E coRⅠ位点,获得重组质粒pSOC-FB。用pSOC-FB转化*** BL 21(DE 3),获得表达FB蛋白的工程菌BL-SOC-FB。在1μg/m l IPTG诱导之下,BL-SOC-FB表达了融合蛋白SOC-FB,其分子量为19 ku。SDS-PAGE检测表明,融合蛋白SOC-FB的最大表达量为细菌总量的24.5%。W estern b lot分析表明,大肠杆菌表达的SOC-FB能与FM DV阳性血清发生特异性反应。

关键词：口蹄疫病毒免疫活性串联片段 SOC基因融合表达

广西黄鸡β-防御素基因的克隆、序列分析与组织分布

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华南农业大学学报 2008年第3期29卷 61-65页

作者：冀君陈燕珊张祥斌陈俊伟马静云毕英佐谢青梅华南农业大学动物科学学院广东广州510642

用设计的特异性引物，采用RT-PCR方法扩增到广西黄鸡β-防御素基因gallinacin-1（简称Gal-1）-gallinacin-13（简称Gal-13）．通过克隆、测序获得这13个基因的cDNA核苷酸序列，并提交到GenBank（Gal-1-Gal-13基因的注册号为：DQ858297-D... 详细信息

用设计的特异性引物，采用RT-PCR方法扩增到广西黄鸡β-防御素基因gallinacin-1（简称Gal-1）-gallinacin-13（简称Gal-13）．通过克隆、测序获得这13个基因的cDNA核苷酸序列，并提交到GenBank（Gal-1-Gal-13基因的注册号为：DQ858297-DQ858310）．比较分析广西黄鸡13种β-防御素Gal-1～Gal-13基因分别与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的相似性，其氨基酸的相似性均在95．5％～100％之间．利用DNAStar软件对所获得的13种广西黄鸡β-防御素基因进行系统发育树分析，结果Gal-1与Gal-5、Gal-12、Gal-2在同一分支上，Gal-6、Gal-7、Gal-9、Gal-8在同一分支上，Gal-10、Gal-11、Gal-4在同一分支，Gal-13独自为一分支．同样用RT-PCR方法分析了广西黄鸡肛防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布，结果发现：Gal-1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-10的表达分布非常广泛，Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-11、Gal-12、Gal-13的分布较少．

关键词：广西黄鸡 β-防御素 gallinacin基因序列分析组织分布

堆形艾美球虫广东株3-1E基因在毕赤酵母中的表达

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中国兽医科学 2006年第11期36卷 890-893页

作者：吴德铭于康震马静云陈峰谢青梅毕英佐曹永长华南农业大学动物科学院基因工程研究室广东广州510642 全国畜牧兽医总站北京100026

以重组质粒pGEM-3-1E为模板,扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株3-1E基因(长度为529 bp),将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中,构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1... 详细信息

以重组质粒pGEM-3-1E为模板,扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株3-1E基因(长度为529 bp),将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中,构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母,甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测,表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。

关键词：堆形艾美球虫 3-1E基因巴斯德毕赤酵母

H9N2禽流感病毒HA全长基因的高效可溶表达及免疫原性研究

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华南农业大学学报 2006年第3期27卷 93-96页

作者：谢青梅李少璃陈丽周庆丰马静云毕英佐曹永长华南农业大学动物科学学院广东广州510642

采用RT-PCR方法扩增了H9N2亚型禽流感病毒(AIV)广东株的血凝素基因HA.将HA基因克隆到笔者所设计的原核表达载体pMBX上,成功构建重组表达质粒pMBX-HA.将其转化到***-21感受态细胞中表达,经SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为96 200的融合... 详细信息

采用RT-PCR方法扩增了H9N2亚型禽流感病毒(AIV)广东株的血凝素基因HA.将HA基因克隆到笔者所设计的原核表达载体pMBX上,成功构建重组表达质粒pMBX-HA.将其转化到***-21感受态细胞中表达,经SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为96 200的融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的29.5%.经蛋白可溶性分析看出,融合蛋白90%以上是以可溶形式表达的.W estern-b lot证实,可溶表达的融合蛋白与H9N2 AIV阳性血清具有良好的免疫反应性.将可溶表达的融合蛋白用体积分数为50%的N i-NTA树脂过柱纯化,用融合蛋白作抗原,通过ELISA方法,能特异性地检测出禽流感阳性血清.

关键词：禽流感病毒 HA基因高效可溶表达免疫原性

近断层脉冲型地震作用下大跨拱桥动力响应分析

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振动与冲击 2024年第9期43卷 94-104,148页

作者：徐略勤袁茂均左英沈正璇徐粒寒重庆交通大学土木工程学院重庆400074 重庆交通大学山区桥梁及隧道工程国家重点实验室重庆400074

为了研究近断层脉冲型地震动的速度脉冲特性和参数对大跨拱桥动力响应的影响规律,首先引入分解叠加(record-decomposition incorporation,RDI)法合成人工近断层脉冲型地震动,对比研究了不同等效脉冲模型的准确性,进而优化和验证了合成方... 详细信息

为了研究近断层脉冲型地震动的速度脉冲特性和参数对大跨拱桥动力响应的影响规律,首先引入分解叠加(record-decomposition incorporation,RDI)法合成人工近断层脉冲型地震动,对比研究了不同等效脉冲模型的准确性,进而优化和验证了合成方法;然后以某大跨拱桥为工程背景,采用优化后的RDI方法合成了具有不同参数特征的人工近断层地震动,探讨了脉冲成分与残余分量对拱桥动力响应的影响机制;最后研究了不同脉冲参数对拱桥动力响应的影响规律。研究表明:优化后的RDI合成方法能有效模拟原始近断层脉冲型地震动,并得到具有不同脉冲参数的人工地震动;近断层地震记录的高频成分对拱桥结构动力响应具有显著的不利影响;随着脉冲幅值的增大,向前方向性效应和滑冲效应对拱桥动力响应的影响均明显增大;随着脉冲周期的增大,两种脉冲效应对拱桥动力响应均有显著的不利影响;对于脉冲个数的影响,双向脉冲的近断层地震动相比多向脉冲会引起拱桥更大的面内响应。

关键词：大跨拱桥近断层脉冲型地震动脉冲参数分解叠加(RDI)法动力响应