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作者：齐嵘嘉重庆医科大学

学位级别：硕士

骨髓造血抑制和以骨量丢失为主的骨质疏松症是化疗常见的副作用。骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）中的干细胞群具有多向分化潜能,既可朝骨系细胞方向分化也可分化为脂肪细胞,成骨/成脂分化平衡是稳定造血微环境成骨细... 详细信息

骨髓造血抑制和以骨量丢失为主的骨质疏松症是化疗常见的副作用。骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）中的干细胞群具有多向分化潜能,既可朝骨系细胞方向分化也可分化为脂肪细胞,成骨/成脂分化平衡是稳定造血微环境成骨细胞龛的必要条件,而成骨细胞龛对维持正向造血调控起着至关重要的作用。既往研究表明氧化应激会导致BMSCs降低成骨分化潜能而朝成脂方向分化,骨髓内成骨细胞及其前体细胞减少,骨髓腔脂肪化,其机制可能与氧化应激促进FOXO与β-catenin结合,激活FOXO转录,抑制β-catenin下游成骨相关因子转录、增强成脂相关因子转录相关。当归多糖（Angelica sinensis Polysaccharides,ASP）是传统中药当归的有效活性成分,具有抗氧化、促造血等功效。课题组前期研究证实ASP可减轻化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）对BMSCs的氧化损伤从而延缓造血细胞氧化应激性早衰。ASP对造血的保护机制是否与ASP减轻成骨细胞龛损伤有关目前尚不清楚。本研究以ASP为研究对象,建立人骨髓基质细胞体外药物模型和小鼠在体化疗药物模型,观察ASP对化疗后骨髓造血抑制的逆转作用,探讨具有抗氧化特性的ASP对造血的保护作用是否与其抑制氧化应激维持骨髓基质细胞分化平衡稳定成骨细胞龛的作用相关,并进一步阐明该作用机制是否与ASP调控FOXO/Wnt-β-catenin信号有关。本研究为深入探究ASP的药理作用以及减轻化疗损伤提供理论思路和实验依据。方法1.以具有多向分化潜能的人骨髓基质细胞细胞株（HS-5）为研究对象,应用5-FU、ASP和Li Cl建立体外药物模型,探讨当归多糖保护5-FU化疗损伤骨髓基质细胞成骨分化潜能、抑制成脂分化能力的作用,及其对β-catenin信号分子的调控作用。CCK-8检测5-FU对HS-5细胞的抑制率,后续实验选择浓度为25μg/m L的5-FU作用HS-5细胞48 h。实验分为对照组:常规培养;ASP组:常规培养基础上加入100μg/m L的ASP;5-FU组:常规培养基础上加入25μg/m L的5-FU;5-FU+ASP组:常规培养基础上加入浓度为100μg/m L的ASP预处理细胞,6 h后加入25μg/m L5-FU。5-FU+Li Cl组:常规培养基础上加入浓度为10 mmol/L的Li Cl预处理细胞,6 h后加入25μg/m L 5-FU,37℃培养48 h。流式细胞术检测HS-5细胞凋亡;细胞成骨诱导分化后茜素红检测成骨结节,测定成骨分化能力;细胞成脂诱导分化后油红O检测脂滴,测定成脂分化能力;Western blot检测HS-5细胞Runx2、PPARγ和β-catenin蛋白的表达;RTq PCR检测Runx2、Osterix、OCN、BMP-2、PPARγ及β-catenin基因的表达。2.采用化疗药物5-FU建立小鼠体内骨髓抑制模型,研究当归多糖预处理对化疗小鼠骨髓造血抑制和骨髓微环境损伤的保护作用及其机制。C57小鼠随机分为对照组:腹腔注射10 m L/kg/d生理盐水7天;ASP组:连续腹腔注射7天100 mg/kg/d ASP;5-FU组:连续腹腔注射6天10m L/kg生理盐水,第7天腹腔注射150 mg/kg 5-FU;5-FU+ASP组:连续腹腔注射6天100 mg/kg/d ASP,第7天同时腹腔注射100 mg/kg ASP和150mg/kg 5-FU。血细胞计数分析仪检测小鼠血液中红细胞、白细胞和血小板数量变化。无菌条件下取C57小鼠双侧股骨和胫骨,制备全骨髓细胞悬液,进行计数。4%多聚甲醛固定股骨,0.5%硝酸脱钙,石蜡切片HE染色光学显微镜下检测小鼠股骨形态学改变;免疫组化检测骨髓成骨细胞SDF-1因子表达。全骨髓法培养小鼠骨髓基质细胞,流式细胞术以及DCFH-DA荧光检测骨髓基质细胞内ROS水平,TBA法、WST-8法、可见光法分别检测骨髓基质细胞MDA含量,Mn SOD和CAT活力;Western blot和RT-q PCR法检测骨髓基质细胞成骨分化与成脂分化的相关指标以及FOXO与Wnt通路中关键信号分子。3.建立小鼠骨髓基质细胞体外药物模型检测成骨成脂分化能力。取C57小鼠股骨和胫骨骨髓细胞进行体外全骨髓细胞培养,贴壁传代至第三代时,细胞分为对照组:常规培养;ASP组:常规培养加入100μg/m L的ASP;5-FU组:常规培养加入25μg/m L 5-FU;5-FU+ASP组:ASP预培养细胞6 h,再加入25μg/m L 5-FU。37℃,5%CO2条件下培养48 h,进行成骨成脂诱导分化,检测成骨成脂分化能力。结果***可以减少5-FU诱导后HS-5细胞凋亡;ASP逆转5-

关键词：骨髓基质细胞分化 5-氟尿嘧啶当归多糖氧化应激 FOXO1 Wnt/β-catenin信号通路 D-gal 衰老非酒精性脂肪肝病 Rg1

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当归多糖减轻5-氟尿嘧啶对骨髓基质细胞成骨分化的抑制

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中国细胞生物学学报 2020年第3期42卷 435-443页

作者：齐嵘嘉肖含先之汪子铃邓方芳吴奇王亚平王璐重庆医科大学干细胞与组织工程研究室组织学与胚胎学教研室重庆400016

该实验探讨当归多糖(ASP)对改善5-氟尿嘧啶(5-FU)所致人骨髓基质细胞成骨与成脂分化失衡的作用。人骨髓基质细胞株HS-5体外培养分为:对照组、ASP组、5-FU组、5-FU+ASP组和5-FU+LiCl组。CCK-8检测细胞抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡;成... 详细信息

该实验探讨当归多糖(ASP)对改善5-氟尿嘧啶(5-FU)所致人骨髓基质细胞成骨与成脂分化失衡的作用。人骨髓基质细胞株HS-5体外培养分为:对照组、ASP组、5-FU组、5-FU+ASP组和5-FU+LiCl组。CCK-8检测细胞抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡;成骨与成脂诱导分化实验检测细胞成骨与成脂分化能力,Western blot检测Runx2、PPARγ和β-catenin蛋白表达,RT-PCR检测Runx2、OCN、BMP-2、Osterix、PPARγ和β-catenin mRNA表达。结果表明,与对照组相比5-FU作用HS-5细胞后细胞增殖抑制、凋亡率增加,成骨分化能力减弱、成脂分化能力增强,分化相关信号β-catenin蛋白和mRNA表达降低;相比5-FU组,ASP预处理可减少细胞凋亡;恢复细胞成骨分化能力,成骨相关因子Runx2、OCN、BMP-2和Osterix表达升高;降低细胞成脂分化能力,成脂相关因子PPARγ表达减少;β-catenin信号分子表达增加。结果提示,当归多糖可维持5-FU作用后骨髓基质细胞朝成骨方向分化的能力,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

关键词： 5-氟尿嘧啶骨髓基质细胞成骨分化 Wnt/β-catenin信号通路当归多糖

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5-氟尿嘧啶通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制骨髓基质细胞增殖

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中国细胞生物学学报 2019年第6期41卷 1059-1066页

作者：肖含先之齐嵘嘉汪子铃肖名贺程霄王亚平王璐重庆医科大学干细胞与组织工程实验室组织学与胚胎学教研室

该研究探讨了5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)抑制人骨髓基质细胞HS-5增殖的可能机制,寻找改善化疗药物对骨髓基质细胞损伤的治疗靶点。实验分3组,对照组:常规培养;5-FU组:常规培养基础上加入25μg/mL 5-FU;氯化锂(LiCl)+5-FU组:10 mm... 详细信息

该研究探讨了5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)抑制人骨髓基质细胞HS-5增殖的可能机制,寻找改善化疗药物对骨髓基质细胞损伤的治疗靶点。实验分3组,对照组:常规培养;5-FU组:常规培养基础上加入25μg/mL 5-FU;氯化锂(LiCl)+5-FU组:10 mmol/L LiCl预处理细胞, 6 h后加入25μg/mL 5-FU,各组培养48 h。EdU检测HS-5细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期, Western blot检测β-catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白表达, DCFH-DA荧光法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平, Western blot检测缝隙连接蛋白Cx43表达。与对照组相比, 5-FU组HS-5细胞增殖能力下降,细胞阻滞在G0/G1期,胞内ROS水平显著升高,β-catenin、 Cyclin D1、C-myc、Cx43蛋白表达下调。与5-FU组相比, LiCl+5-FU组HS-5细胞增殖能力回升,细胞G1期阻滞减轻,胞内ROS水平降低,β-catenin、Cyclin D1、C-myc、Cx43蛋白表达上调。5-FU可通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制HS-5细胞增殖,其作用机制可能与5-FU诱导细胞发生氧化应激,下调细胞间隙连接蛋白Cx43表达有关。

关键词： 5-氟尿嘧啶 Wnt/β-catenin信号通路氯化锂 HS-5

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当归多糖对人白血病干细胞体外增殖与体内移植模型的影响

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解剖学报 2021年第1期52卷 41-48页

作者：邓方芳耿珊姜蓉汪子铃肖含先之齐嵘嘉黄彩虹曾娣李赓王璐王亚平重庆医科大学干细胞与组织工程研究室组织学与胚胎学教研室重庆400016

目的探讨当归多糖(ASP)对人白血病干细胞(LSCs)增殖及体内移植的影响。方法***对CD34^(+)CD38^(-)人LSCs体外增殖的影响。免疫磁性法分选正常人和髓系白血病患者骨髓中CD34^(+)CD38^(-)细胞,分为正常CD34^(+)CD38^(-)对照组、CD34^(+)CD... 详细信息

目的探讨当归多糖(ASP)对人白血病干细胞(LSCs)增殖及体内移植的影响。方法***对CD34^(+)CD38^(-)人LSCs体外增殖的影响。免疫磁性法分选正常人和髓系白血病患者骨髓中CD34^(+)CD38^(-)细胞,分为正常CD34^(+)CD38^(-)对照组、CD34^(+)CD38^(-)LSCs对照组、正常CD34^(+)CD38^(-)ASP组和CD34^(+)CD38^(-)LSCs ASP组,后两组在常规培养基础上加入ASP(终浓度40 mg/L)。流式细胞术检测CD34^(+)CD38^(-)细胞纯度;锥虫蓝染色检测细胞存活率;细胞计数试剂盒8(CCK-8)和混合集落形成单位(CFU-Mix)检测CD34^(+)CD38^(-)LSCs增殖分化能力;RT-PCR检测衰老相关基因表达水平。***对人LSCs移植小鼠模型的影响。体内移植LSCs建立CD34^(+)CD38^(-)LSCs小鼠移植模型,随机分为ASP移植模型组[腹腔注射ASP,200 mg/kg,(1次/d)×14 d]和移植模型组(注射等时、等量生理盐水)。药物注射完成第2天,计数白细胞总数和分类计数,观察血细胞形态;免疫荧光细胞化学法检测受体鼠骨髓中CD34^(+)CD38^(-)LSCs;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测染色阳性骨髓单核细胞(BMMCs)百分率;流式细胞术检测BMMCs细胞周期分布;CFU-Mix培养检测BMMCs集落形成能力。结果分选后CD34^(+)CD38^(-)细胞纯度达到(91.14±1.02)%,细胞存活率为(95.42±3.5)%;CD34^(+)CD38^(-)LSCs对照组细胞增殖与集落形成能力显著高于正常CD34^(+)CD38^(-)对照组;CD34^(+)CD38^(-)LSCs ASP组细胞增殖能力与集落形成能力明显低于CD34^(+)CD38^(-)LSCs对照组;CD34^(+)CD38^(-)LSCs ASP组细胞高表达p16^(INK4a)、p19^(Arf)、p53、p21^(Cip1/Waf1)基因。移植CD34^(+)CD38^(-)LSCs后小鼠骨髓中存在人源性LSCs。移植模型组小鼠白细胞总数增加,中性粒细胞比例升高,淋巴细胞比例降低;注射ASP可明显降低白细胞总数和中性粒细胞比例,淋巴细胞比例有所升高;处于G0/G1期中的BMMCs数量增加,S期细胞数量减少;SA-β-Gal染色阳性细胞百分率明显提高;CFU-Mix集落形成数显著减少。结论ASP在体内与体外均能抑制CD34^(+)CD38^(-)LSCs增殖,推测其可能机制与ASP调节细胞衰老相关基因表达密切相关。

关键词：当归多糖人白血病干细胞增殖抑制体内移植细胞衰老流式细胞术小鼠

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