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用荧光共振能量转移技术构建的蛋白酶检测器

用荧光共振能量转移技术构建的蛋白酶检测器

作者：齐小娟浙江大学

学位级别：硕士

1 背景及目的自1948年Forster等人提出荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)理论后,因其对距离的极度敏感性,FRET技术被广泛用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等方面的研究。而在维多利亚水... 详细信息

1 背景及目的自1948年Forster等人提出荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)理论后,因其对距离的极度敏感性,FRET技术被广泛用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等方面的研究。而在维多利亚水母中发现的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)及其变体的成功克隆和分离,为FRET技术提供了适宜的供受体对,大大促进了FRET技术的发展。近来,FRET以它稳定、无生物毒性、不需任何外源反应底物及表达无种属和组织特异性的优点,成为检测蛋白一受体、蛋白一蛋白之间相互作用和相对空间位置的“分子尺”。以FRET技术构建的生物传感器具有高灵敏度和高特异性,成为高通量筛选(High Throughput Screen, HTS)的最好系统之一。前列腺特异抗原(prostate specific antigen, PSA)是一种主要由前列腺上皮层分泌的丝氨酸蛋白酶,是目前临床上对前列腺癌进行早期诊断及监测的敏感的血清学指标。然而血清PSA水平并不具有疾病特异性,一些良性的前列腺疾病如前列腺增生等亦会引起血清总PSA含量的升高,尤其是血清中的总PSA含量在4～10ng/ml之间时,更难以做出鉴别诊断。因而其作为前列腺癌早期诊断指标的特异性还有待提高。研究表明,区分以及检测血清中不同形式存在的PSA浙江大学硕士学位论文齐小娟能够提高前列腺癌诊断的特异性。其中具有蛋白酶活性的PSA亦是可能的肿瘤标志物之一。但常规的免疫学方法无法予以有效鉴别。因此探索新的检测方法是非常必要的。本研究的目的是:①构建可在体外应用荧光共振能量转移(FRET)技术检测具有酶活性的前列腺特异抗原(PSA)的生物检测器。②在此基础上,建立一套能普遍使用的蛋白酶活性检测的体外FRET系统,并选用半肤天冬蛋白酶一3(casPase一3)对其可行性进行验证和分析。2方法2.1本实验室的前期工作已成功构建原核细胞表达质粒PET-cFP一ssYYsG一YFP,从而可在大肠杆菌中诱导表达在供体增强型青色荧光蛋白(enhaneed eyan fluoreseent protein,ECFp)和受体增强型黄色荧光蛋白(enhaneed yellow nuoreseent protein,EYFp)之间以psA特异性识别氨基酸序列ssYYsG(ser一se卜val一val一ser一Gly)连接的融合蛋白。将纯化的融合蛋白依次用糜蛋白酶、胰蛋白酶、商品化的纯品PSA及精液切割,检测其荧光共振能量转移现象的变化。2.2在上述实验完成的基础上,我们用PCR技术从含有ecfP基因的质粒中扩增出在其两端加有限制性内切酶酶切位点的ecfP基因。然后把ecfn基因连入原核细胞表达质粒pET30a(+)一YFP中,获得一个原核细胞表达质粒pET30a(+)一CFP-多克隆位点(MCS)一YFP。在多克隆位点处可灵活插入多种蛋白酶的识别肤段的编码序列,通过观察其融合蛋白FRET现象的变化可对多种蛋白酶活性进行体外检测。为验证实验设计的可行性,在多克隆位点处插入caspase一3的特异性识别切割氨基酸序列DEVD(AsP一Glu一Va!一AsP)的编码序列,进而在大肠杆菌中诱导表达ECFP一DEVD一EYFP融合蛋白。在体外将纯化的融合蛋白与用凋亡诱导剂量DNA损伤剂MNNG处理后继续培养48h的FL细胞裂解液在室温下孵育,观察其荧光共振能量转移效应的变化。

关键词：荧光共振能量转移前列腺特异抗原增强型青色荧光蛋白增强型黄色荧光蛋白生物传感器融合蛋白表达质粒

miR-17-92基因簇与肿瘤血管生成关系的研究进展

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广东医学 2016年第6期37卷 942-944页

作者：齐小娟杨万勇李涛广东医学院医学检验学院广东东莞523808 广东省东莞市同济光华医院检验科 523416

血管生成（angiogenesis）是指从已有的血管发展而形成新的血管的动态过程。在肿瘤的生长、侵袭、转移等过程中起着关键作用,针对肿瘤血管生成机制的研究可以为肿瘤治疗提供新的线索。肿瘤血管生成是一个复杂的多因素参与调节的过程,目... 详细信息

血管生成（angiogenesis）是指从已有的血管发展而形成新的血管的动态过程。在肿瘤的生长、侵袭、转移等过程中起着关键作用,针对肿瘤血管生成机制的研究可以为肿瘤治疗提供新的线索。肿瘤血管生成是一个复杂的多因素参与调节的过程,目前对肿瘤血管生成的机制了解的还不够全面,对于肿瘤血管生成机制的揭示是现阶段肿瘤研究中的热点之一。

关键词：肿瘤血管生成机制基因簇肿瘤研究 miR-17-92基因簇

构建以荧光共振能量转移技术为基础的生物学活性前列腺特异抗原检测器

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中国药理学与毒理学杂志 2005年第3期19卷 229-236页

作者：齐小娟王政蔡朱男张斌余应年浙江大学医学院病理生理学教研室浙江杭州310031

目的　构建可在体外应用荧光共振能量转移(FRET)技术检测具有酶活性的前列腺特异抗原(PSA)的生物检测器。方法　构建原核细胞表达质粒,从而在大肠杆菌中表达在供体和受体荧光蛋白之间以PSA特异性识别氨基酸序列SSYYSG连接的融合蛋白。... 详细信息

目的　构建可在体外应用荧光共振能量转移(FRET)技术检测具有酶活性的前列腺特异抗原(PSA)的生物检测器。方法　构建原核细胞表达质粒,从而在大肠杆菌中表达在供体和受体荧光蛋白之间以PSA特异性识别氨基酸序列SSYYSG连接的融合蛋白。将纯化的融合蛋白依次用糜蛋白酶、胰蛋白酶、商品化的纯品PSA及精液切割,检测其荧光共振能量转移现象的变化。结果　糜蛋白酶、商品化的纯品PSA及精液切割均可有效抑制融合蛋白的FRET现象,并表现出对时间和剂量的依赖关系。而胰蛋白酶在90min内未见FRET抑制现象。结论　本研究构建的FRET检测器可成功检测具有酶活性的PSA ,为活性PSA的检测提供一种可选择的途径。

关键词：荧光共振能量转移前列腺特异抗原荧光蛋白生物传感技术

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小学语文阅读教学初探

东方青年·教师 2011年第7期 187-188页

作者：齐小娟河南滑县中澳双语学校

博览群书,可以开阔思路,活跃文思.《语文课程标准》也明确指出:“培养学生广泛的阅读兴趣,扩大阅读面,增加阅读量,提倡少做题,多读书,读好书,读整本的书.”由于学生年龄小,阅读量少,并且缺乏生活体验,阅览书籍往往具有盲目性和随意性,... 详细信息

博览群书,可以开阔思路,活跃文思.《语文课程标准》也明确指出:“培养学生广泛的阅读兴趣,扩大阅读面,增加阅读量,提倡少做题,多读书,读好书,读整本的书.”由于学生年龄小,阅读量少,并且缺乏生活体验,阅览书籍往往具有盲目性和随意性,严重影响阅读的质量.因此,本人在提高课堂教学效率,确保完成教学任务的前提下,每周抽出1-2节课作为学生的大阅读课,来扩大学生的阅读量,提高学生的阅读能力.

关键词：小学语文阅读学生年龄阅读量语文课程标准课堂教学效率大阅读阅读兴趣阅读能力生活体验培养学生教学任务阅读课随意性盲目性高学生大学生质量阅览思路

来源：评论

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企业财务风险的控制

现代审计与经济 2011年第2期 12-13页

作者：齐小娟陕西省交通建设集团公司

一、建立企业财务风险识辨系统,编制现金流量预算企业在发展壮大过程中,组织规模不断变大,组织结构也日趋复杂,这些都使得企业的管理复杂多变,财务风险也越来越大。而现金流量作为跟企业生存、发展和壮大息息相关的生命＂血液＂,其在企... 详细信息

一、建立企业财务风险识辨系统,编制现金流量预算企业在发展壮大过程中,组织规模不断变大,组织结构也日趋复杂,这些都使得企业的管理复杂多变,财务风险也越来越大。而现金流量作为跟企业生存、发展和壮大息息相关的生命＂血液＂,其在企业管理中所发挥的作用也越来越大,因此作为企业,必须对现金流量的信息予以充分的重视,有效的管理与控制现金流量,

关键词：企业财务风险现金流量预算企业管理组织规模组织结构企业生存

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数字游戏在小学数学教学中的运用

数学学习与研究 2024年第28期 98-101页

作者：齐小娟甘肃省庆阳市庆城县逸夫小学甘肃庆阳745100

数字游戏对于点燃学生的学习激情和增强他们的理解能力具有显著的作用.数字游戏不仅可以激发学生的数学思维,提升他们的问题解决技巧,还可以增进课堂互动的质量.文章根据笔者的教学经验和实际的教学实例,向教师展示了一套数字游戏在小... 详细信息

数字游戏对于点燃学生的学习激情和增强他们的理解能力具有显著的作用.数字游戏不仅可以激发学生的数学思维,提升他们的问题解决技巧,还可以增进课堂互动的质量.文章根据笔者的教学经验和实际的教学实例,向教师展示了一套数字游戏在小学数学教学中的运用方法及其建议,希望能为学生的全面发展提供实用的指导.

关键词：数字游戏小学数学教学方法

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AI智课环境下小学数学互助释疑教学分析

中国新通信 2024年第19期26卷 167-169页

作者：齐小娟甘肃省庆阳市庆城县逸夫小学

基于AI智能环境的互助释疑教学,属于以生为本的一种教学模式,主要目标是实现学生自学能力、合作精神、问题解决能力的提升,同时促进教师发展。本文基于AI智课和小学互助释疑教学界定,分析小学数学互助释疑教学的功能,探讨AI智课环境下... 详细信息

基于AI智能环境的互助释疑教学,属于以生为本的一种教学模式,主要目标是实现学生自学能力、合作精神、问题解决能力的提升,同时促进教师发展。本文基于AI智课和小学互助释疑教学界定,分析小学数学互助释疑教学的功能,探讨AI智课环境下如何开展小学数学互助释疑教学,以期能够激发学生数学学习兴趣,提升其优质的探疑、质疑以及释疑能力。

关键词：小学数学互助释疑 AI智课教学