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周期性应力加载对体外培养肌管极性与分化的影响

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周期性应力加载对体外培养肌管极性与分化的影响

作者：黄维一南方医科大学

学位级别：硕士

骨骼肌是由平行排列多核极性肌管组成的肌纤维束,各肌管间协同作用,共同完成收缩功能[’];先天性缺陷、损伤、肿瘤、原发性肌病、代谢性疾病等各种原因容易造成骨骼肌结构缺损和功能丧失。传统治疗方法主要是肌皮瓣移植,但由于可利用的... 详细信息

骨骼肌是由平行排列多核极性肌管组成的肌纤维束,各肌管间协同作用,共同完成收缩功能[’];先天性缺陷、损伤、肿瘤、原发性肌病、代谢性疾病等各种原因容易造成骨骼肌结构缺损和功能丧失。传统治疗方法主要是肌皮瓣移植,但由于可利用的肌肉来源有限,对供区损伤较大,以及异体移植供体来源和免疫排斥等问题,使其应用受到限制[2];近年来,也有研究者尝试用成肌干细胞移植以促进肌纤维再生,治疗遗传性肌病,但存在移植的成肌细胞在体内分布不均、存活率低及免疫排斥等问题[3];骨骼肌组织工程的发展给损伤结构和功能的修复带来了希望[4-5],而极性多核肌管的体外培养和活性维持是成功构建功能性再生肌组织的关键因素[6]。近年骨骼肌组织工程研究的重点,在于如何优化成肌干细胞体外培养条件以获得功能性极性多核肌管,研究者在具有导向结构三维支架的应用、对体外培养的分化肌管施加定向的磁力、电及机械拉伸刺激等方面进行了尝试,并取得了一定进展[7-10]。在体组织处于复杂的生长环境,其中力学刺激的作用极大地影响着组织的形态结构和功能。持续性被动张力在人体发育过程中,促进骨骼肌组织的变长、增粗,体力劳动和体育锻炼也能增加肌纤维的数量及直径。生理条件下,力学应激是维持细胞生存和生长的重要细胞外刺激,影响细胞的生长行为,调节细胞的新陈代谢和基因表达过程,在细胞的激活、增殖与分化中扮演重要角色[11-12]。研究表明,力学拉伸加载对成肌细胞具有双向影响,适宜的拉伸能够促进细胞的增殖,而过度拉伸则促使细胞凋亡[13]。力学刺激信号对细胞的生长、发育有何具体影响,又是通过何种途径改变细胞生长状况,已成为细胞生物力学近年的研究热点。国外多个研究组已证实,对构建的肌组织进行周期性的力学加载,模拟体内骨骼肌组织的生长发育过程,能够明显影响再生肌组织的活性、生存周期以及收缩功能[11,14-17]。体外培养条件下,能否获取极性多层肌管,是三维肌组织模型构建成功的关键。成熟肌组织模型内的肌纤维存在平行排列特性,是肌组织发挥收缩功能的形态学基础。Sylgard184属于硅酮橡胶弹性材料,其双组分混合固化后,有柔性基底层特征,表面光滑并具有一定的弹性,便于对弹性基质材料上的极性多层肌管进行力学加载[18]。我们实验组前期对体外三维肌组织构建方面进行了初步探索,运用Matrigel及Ⅰ型胶原修饰的Sylgard支架作为细胞基质与C2C12细胞共培养,获得了极性多层分化肌管。在此基础上,采用自制的体外细胞拉伸仪,我们对柔性基质材料表面粘附生长的三维肌组织模型(极性多层肌管)施以不同频率的周期性应力加载,检测并分析比较不同力学加载条件下肌管的形态特征及分化表型,以筛选优化的肌组织体外应力加载培养条件,探讨不同频率的周期性应力加载对多层肌管极性与分化的影响。此外,我们应用自制细胞拉伸仪和Flexcell力学加载系统,分别对体外三维和平面培养的肌管施以周期性应力加载,比较研究力学加载条件下,不同培养条件对体外培养肌管分化和极性的影响,进一步探究三维极性生长对成熟肌组织模型构建的重要性。本文内容结构第一章体外极性多层肌管的获取及检测 [目的] 利用修饰的铸型Sylgard184三维支架与C2C12细胞复合培养、诱导分化获取体外极性多层肌管,检测肌管的生长和功能特性。 [方法] Sylgard184双组分以10：1的比例均匀混合,倒入6孔板中,室温下静置固化,用PBS液冲洗固化的Sylgard184表面压痕铸型,Matrigel和Ⅰ型胶原(混合比例1：6)混合液均匀铺被凹槽底部,每个凹槽加入混合液0.3ml,确保细胞基质成份的均匀覆盖,自然干燥并紫外消毒,每个Sylgard184铸型凹槽接种2mL浓度为(1.0～2.0)×105个/mL的C2C12细胞悬液,待细胞达80%-90%融合时,弃去全培培养基,加入含2%马血清的DMEM/F12培养液。分化培养7d后,倒置显微镜形态学观察摄片,继续分化至10d后,采用扫描电镜观察肌管形态和肌管间的连接,RT-PCR检测Myogenin、Desmiin、MyHC基因mRNA表达情况,免疫荧光检测分化肌管Desmin、MyHC的蛋白表达。 [结果] C2C12细胞诱导分化7d,形态学观察可见肌管呈极性分化,肌管之间相互融合。继续分化至10d,形态学观察可见肌管之间排列紧密且相互重叠,具有多层分化及极性排列特性;RT-PCR检测证实Myogenin、Desmin、MyHC基因mRNA的阳性表达,免疫荧光检测以及DAPI核染,进一步验证极性肌管内分化特异性标志蛋白Desmin、MyHC的表达：Desmin、MyHC是肌细胞骨架的主要成份,主要分布在胞浆,是骨骼肌分化成熟的标志分子之一,其阳性表达证实再生肌组织的成肌特征以及极性肌管的形成。 [结论] 修饰并铸型的Sylg

关键词： C2C12 Sylgard184 极性肌管应力加载 Flexcell 分化三维

不同频率周期性应力加载对体外多层肌管极性及分化的影响

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中国修复重建外科杂志 2012年第6期26卷 735-742页

作者：黄维一刘幸卉陈荣冯利强廖华余磊曾慧君南方医科大学解剖学教研室广东省组织构建与检测重点实验室广州510515 宁夏医科大学解剖教研室

目的探讨不同频率的周期性应力加载对体外培养多层肌管极性与分化的影响,筛选优化的肌组织体外应力加载培养条件。方法体外培养C2C12成肌细胞于Sylgard 184铸型凹槽诱导分化形成多层肌管组织,采用自制体外细胞拉伸仪,对培养并分化的肌... 详细信息

目的探讨不同频率的周期性应力加载对体外培养多层肌管极性与分化的影响,筛选优化的肌组织体外应力加载培养条件。方法体外培养C2C12成肌细胞于Sylgard 184铸型凹槽诱导分化形成多层肌管组织,采用自制体外细胞拉伸仪,对培养并分化的肌管进行间歇性应力加载:加载幅度10%,加载频率分别为0(A组)、0.25(B组)、0.50(C组)、1.00 Hz(D组),加载时间3次/d,每次1 h。连续加载5、7、10 d时,观察各组肌管形态;RT-PCR和实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,QRT-PCR)分析检测成肌相关基因成肌分化抗原(myogenic differentiationantigen,MyoD)、肌细胞生成素(Myogenin)、结蛋白(Desmin)、肌球重链蛋白(myosin heavy chain,MyHC)mRNA的表达差异。结果倒置相差显微镜观察示,应力加载促进各组肌管的极性融合及数量增加,其中B组加载培养7 d时,多层肌管排列紧密,极性显著。加载条件能促进成肌相关基因mRNA的表达:组内随加载时间延长,各组MyoD的mRNA表达逐渐下降,7、10 d与5 d比较差异均有统计学意义(P0.05)外,其余各时间点比较差异均有统计学意义(P0.05)外,其余各组与B组各相关基因mRNA表达比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论低频(0.25 Hz)、适时(7 d)的周期性应力加载有利于生长于Sylgard 184弹性材料表面的多层肌管极性分化,但随着应力加载时间延长,肌管的老化加速。

关键词： C2C12成肌细胞应力加载分化肌管体外实验

周期性力学刺激对成肌细胞自身抗原表达的影响

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中国修复重建外科杂志 2013年第9期27卷 1128-1133页

作者：陈荣刘幸卉黄维一曾慧君史丹丹曹标廖华南方医科大学解剖学教研室广东省组织构建与检测重点实验室广州510515

目的探讨周期性力学刺激对体外培养的成肌细胞自身抗原表达的影响。方法取C2C12细胞根据处理方法不同分为实验组及对照组,其中实验组分为4个亚组,即2、4、6 d周期性拉伸组(2、4、6 d拉伸组)及1 d拉伸组。2、4、6 d拉伸组:细胞置于Flexer... 详细信息

目的探讨周期性力学刺激对体外培养的成肌细胞自身抗原表达的影响。方法取C2C12细胞根据处理方法不同分为实验组及对照组,其中实验组分为4个亚组,即2、4、6 d周期性拉伸组(2、4、6 d拉伸组)及1 d拉伸组。2、4、6 d拉伸组:细胞置于Flexercell 5000柔性基底加载系统,以0.25 Hz拉伸频率、10%拉伸幅度进行每天2 h应力加载,连续加载2、4、6 d;1 d拉伸组:细胞置于Flexercell 5000柔性基底加载系统,以1 Hz拉伸频率、15%拉伸幅度拉伸1 h,23 h后收集细胞;对照组:细胞常规培养1、2、4、6 d。培养期间于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。采用流式细胞仪检测细胞增殖情况,Western blot检测自身抗原DNA依赖蛋白激酶催化亚基(Ku/the catalytic subunit of DNAdependent protein kinase,DNA-PKcs)、Mi-2(reconfigurable components deacetylase complexes of NuRD)、U1-70(A part of ATP-dependent DNA helicaseⅡ)、组氨酰-tRNA合成酶(histidyl tRNA synthetase,HRS)表达情况。结果经培养后,1 d拉伸组可见脱落细胞,对照组1 d时无细胞脱落;2 d拉伸组细胞增殖较对照组2 d时明显;4 d拉伸组细胞出现分化,6 d拉伸组细胞部分融合,与对照组4、6 d时情况一致。1 d拉伸组细胞经单次拉伸后出现凋亡,相对DNA增殖指数(relative DNA proliferation index,DPI)与对照组1 d时比较,差异无统计学意义(t=0.346,P=0.747)。经周期性拉伸后,2、4 d拉伸组DPI较对照组2、4 d时显著提高(P0.05)。4 d拉伸组各抗原蛋白相对表达量均较2 d拉伸组显著增加(P<0.05),而对照组4 d时均较2 d时显著降低(P<0.05)。结论短期力学刺激可以抑制成肌细胞自身抗原表达,但随时间延长,细胞分化融合以及对力学刺激的适应使其对自身抗原表达抑制作用减弱。

关键词：力学刺激成肌细胞自身抗原特发性炎性肌病

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不曾遗忘的风景(组诗)

文学界（原创版） 2008年第8期 77-78页

作者：黄维一

应力加载对体外培养C2C12细胞自身抗原及TLR3的影响

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中国临床解剖学杂志 2013年第6期31卷 688-691页

作者：冯利强陈荣刘幸卉黄维一曾慧君廖华南方医科大学解剖教研室广东省组织构建与检测重点实验室广州510515 宁夏医科大学解剖教研室银川750004

目的探讨机械应力加载是否干扰体外培养C2C12成肌细胞自身抗原及TLR3的转录表达。方法对生长于BioFlex柔性基底膜表面的C2C12细胞施加不同频率的拉伸加载,流式细胞术分析细胞增殖情况。Real-time RT-PCR检测并比较分析应力加载前、后骨... 详细信息

目的探讨机械应力加载是否干扰体外培养C2C12成肌细胞自身抗原及TLR3的转录表达。方法对生长于BioFlex柔性基底膜表面的C2C12细胞施加不同频率的拉伸加载,流式细胞术分析细胞增殖情况。Real-time RT-PCR检测并比较分析应力加载前、后骨骼肌自身抗原(HRS、Mi-2、U1-70、DNA-PKcs)、TLR3的mRNAs表达差异。结果 0.25 Hz、10%幅度、2 h/d的拉伸条件能加速C2C12细胞进入细胞周期。2 d和4 d拉伸组DPI较对照组提高(P一培养时间的对照组(P<0.05)。结论机械应力刺激信号可能参与下调与骨骼肌组织炎症相关的免疫调节分子。

关键词：应力加载 C2C12 自身抗原 TLR3

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子宫肌瘤手术切除患者的围手术期护理

常州实用医学 2017年第6期33卷 412-413页

作者：黄维一常州市第二人民医院妇科江苏常州213003

较大的子宫肌瘤常需手术切除治疗，针对子宫肌瘤手术切除患者要加强围手术期护理，做好心理护理、术前准备、术后注意体位护理、观察生命体征和尿液、注意饮食护理和术后并发症的护理，并做好出院宣教，以促进患者早日康复。

关键词：子宫肌瘤围手术期护理

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蛛网膜下隙出血病人创伤性应激障碍研究进展

护理研究 2018年第17期32卷 2661-2665页

作者：尹庆黄云娟马颖君黄维一南京医科大学附属无锡市人民医院

对蛛网膜下隙出血(SAH)病人创伤后应激障碍(PTSD)的常用测量工具,研究现状,PTSD对SAH病人生活质量、睡眠、疲劳的影响及对家属的影响,常用的治疗方法进行综述。

关键词：蛛网膜下隙出血创伤后应激障碍测量工具影响因素生活质量睡眠疲劳综述

品管圈活动提高体液标本送检正确率的效果分析

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常州实用医学 2020年第2期36卷 120-121页

作者：黄维一张闻熙常州市第二人民医院妇科江苏常州213003

目的分析品管圈活动提高体液标本送检正确率的效果。方法对妇科住院患者体液标本收集送检过程应用“呵护圈”品管圈活动。对活动前住院患者体液标本送检率不高的情况进行原因分析,制定并组织实施相应改正措施,统计开展品管圈活动后体液... 详细信息

目的分析品管圈活动提高体液标本送检正确率的效果。方法对妇科住院患者体液标本收集送检过程应用“呵护圈”品管圈活动。对活动前住院患者体液标本送检率不高的情况进行原因分析,制定并组织实施相应改正措施,统计开展品管圈活动后体液标本送检情况。结果品管圈管理活动后,住院患者体液送检正确率较前均明显提高,正确率上升至89.1%。结论品管圈活动应用于住院患者体液标本收集与送检过程,不仅提高了体液标本送检正确率,并让护士学会了以科学的方式思考问题,增强了解决问题的自信与能力,从而提高了护理工作质量。

关键词：品管圈活动体液标本送检正确率效果

神经生长因子诱导后的神经元样PC12细胞与成肌干细胞共培养的实验研究

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中华创伤骨科杂志 2012年第5期14卷 433-437页

作者：刘幸卉黄维一陈荣冯利强廖华余磊曾慧君南方医科大学解剖学教研室广州510515

目的探讨神经元样PC12细胞对C3H小鼠成肌干细胞C2C12增殖与分化的影响。方法利用Transwell建立PC12细胞和C2C12细胞共培养体系，实验分为3组：空白对照组：C2C12细胞单独培养；实验组：C2C12细胞与已分化的PC12细胞共培养；阴性对照组：... 详细信息

目的探讨神经元样PC12细胞对C3H小鼠成肌干细胞C2C12增殖与分化的影响。方法利用Transwell建立PC12细胞和C2C12细胞共培养体系，实验分为3组：空白对照组：C2C12细胞单独培养；实验组：C2C12细胞与已分化的PC12细胞共培养；阴性对照组：C2C12细胞与未分化的PC12细胞共培养。免疫荧光染色鉴定神经生长因子（NGF）对PC12细胞的促分化效应；流式细胞仪检测共培养条件下C2C12细胞的增殖情况；逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）和实时荧光定量核酸扩增（qPCR）检测与PC12细胞共培养3、7d后C2C12细胞生肌素、结蛋白基因的表达。结果体外条件下，NGF诱导PC12细胞呈现神经元样特征：具有细长的细胞突起，并阳性表达微管相关蛋白-2。流式细胞检测证实：已经分化的PC12细胞抑制C2C12细胞的增殖。实验组DNA合成前期的C2C12细胞所占百分比（77．2％±0．4％）较空白对照组（71．0％±0．6％）和阴性对照组（70。8％±0．8％）高，反应增殖活力的增殖指数（22．8％±0．4％）较空白对照组（29．0％±0．6％）和阴性对照组（29．2％±0．8％）低，差异均有统计学意义（P〈0．05）。实验组C2C12细胞生肌素、结蛋白基因的表达高于同一培养时间其他组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论神经化的PC12细胞抑制C2C12细胞的增殖，但促进其分化。

关键词：成肌细胞小鼠近交C3H PC12细胞细胞增殖细胞分化