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基于酵母转化偶联重组（TAR）技术的PDCoV反向遗传学操作系统的构建与应用

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基于酵母转化偶联重组（TAR）技术的PDCoV反向遗传学操作系统的构...

作者：张钰灿河南农业大学

学位级别：硕士

猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种新型的猪肠道冠状病毒,可引起新生仔猪急性腹泻、呕吐和死亡。2014年,PDCoV在美国猪群中首次爆发,随后迅速传播至全球多个国家,给世界养猪业带来了巨大威胁。然而,截至目前还没有... 详细信息

猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种新型的猪肠道冠状病毒,可引起新生仔猪急性腹泻、呕吐和死亡。2014年,PDCoV在美国猪群中首次爆发,随后迅速传播至全球多个国家,给世界养猪业带来了巨大威胁。然而,截至目前还没有用于可预防PDCoV感染的有效疫苗或药物。近年来,基于反向遗传操作技术的高通量筛选技术加速了新型抗病毒药物的研发进程。冠状病毒的基因组较大,结构复杂,导致冠状病毒的反向遗传操作系统构建异常艰难。酵母转化相关重组（TAR）克隆技术被用于快速高效地构建病毒感染性c DNA克隆,然而,TAR克隆技术是否适用于构建PDCoV反向遗传操作系统未有报道。本研究利用TAR技术,成功构建了PDCoV感染性c DNA克隆,基于该系统成功拯救了重组病毒r PDCoV和报告病毒r PDCoV-e GFP,利用所拯救的报告病毒成功建立了抗病毒药物筛选平台,并利用该平台筛选出了3种有潜力的抗PDCoV药物。具体研究内容如下:***全长感染性c DNA克隆的构建和病毒拯救为获得PDCoV全长感染性c DNA克隆及拯救PDCoV重组病毒,将PDCoV的基因组分为A-F六个片段,并分别在基因组的5’端和3’端插入T7启动子序列和ASC I酶切位点,同时为了与亲本病毒相区分,对B片段中的氨基酸做了同义突变作为遗传标记。随后,我们将制备好的基因组各片段及线性化的p GF载体转化至酵母菌株VL6-48N中一步获得PDCoV的c DNA感染性克隆。并将成功筛选的PDCoV阳性c DNA感染性克隆进行线性化、体外转录获得全长的基因组m RNA,将其与N基因的m RNA共同电转染至LLC-PK1细胞中从而获得重组病毒r PDCoV。通过对重组病毒连续传代及生物学特性分析,结果表明,我们通过TAR克隆技术获得的PDCoV全长c DNA克隆可用于拯救重组PDCoV,且拯救的重组病毒表现出与亲本病毒相似的生长特性。***-e GFP报告病毒全长感染性克隆的构建和病毒拯救为拯救可视化的报告病毒,本试验选取e GFP基因与PDCoV辅助蛋白NS6基因进行替换从而构建PDCoV-e GFP报告病毒,并进行r PDCoV-e GFP报告病毒的拯救。首先将r PDCoV-e GFP的感染性克隆分为8个片段,其中A-E片段同试验一,除此之外,含有NS6基因的F片段被分为三个亚片段,即F1、e GFP和F2片段,之后,按照与试验一相同的方法进行报告病毒r PDCoV-e GFP全长感染性克隆的构建及病毒拯救。通过对报告病毒r PDCoV-e GFP的生物学特性检测发现,本研究所拯救的报告病毒r PDCoV-e GFP能够在LLC-PK1细胞中稳定传代,并且复制过程中能够产生较强的荧光信号。3.利用构建的r PDCoV-e GFP报告病毒进行抗病毒药物筛选平台的建立和应用为建立抗PDCoV的药物高通量筛选平台,本试验首先选定了一种已知的阳性抗病毒药物利巴韦林作为阳性对照,利用报告病毒r PDCoV-e GFP分别通过流式细胞术和荧光强度分析的方法初步建立了PDCoV抗病毒药物的筛选平台。Z因子和Z’因子分别为0.821和0.838（>0.5）,表明该方法可用于抗病毒药物的高通量筛选。随后通过初步建立的抗病毒药物筛选平台,对潜在的三种抗病毒药物绿原酸（Chlorogenic acid）、芹黄素（Apigenin）、二氢杨梅素（Dihydromyricetin）的抗病毒效果进行评估。结果显示,Chlorogenic acid、Apigenin、Dihydromyricetin对r PDCoV-e GFP具有较强的抗病毒作用,药物的选择性指数（SI）分别为58.71、57.49和23.74。进一步通过流式细胞术及荧光强度分析的方法检测了上述三种药物对PDCoV亲本毒株的抑制效率,结果证实了这三种药物均能够抑制PDCoV亲本毒株的复制。结果表明我们基于构建的r PDCoV-e GFP报告病毒成功建立了抗病毒药物筛选平台,并且成功筛选到三种有效的靶向PDCoV的抗病毒药物,值得进一步研究。综上所述,本研究首次利用酵母TAR克隆技术构建了PDCoV反向遗传学操作平台,并基于构建的r PDCoV-e GFP报告病毒初步建立了抗病毒药物筛选平台,筛选出了三种潜在的抗PDCoV药物。本研究为PDCoV抗病毒药物的研发提供了平台,拓展了我们对食源性化合物药用价值的认识和应用。

关键词：猪δ冠状病毒反向遗传学酵母转化偶联重组克隆(TAR) 抗病毒药物筛选平台

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绿色信贷对商业银行信贷风险的影响研究

绿色信贷对商业银行信贷风险的影响研究

作者：梅灿安徽财经大学

学位级别：硕士

高性能绿光激光器件的设计及光热性能调控研究

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高性能绿光激光器件的设计及光热性能调控研究

作者：李星灿河南工业大学

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基于声发射的松散堆积体滑移过程研究

基于声发射的松散堆积体滑移过程研究

作者：李龙灿四川师范大学

学位级别：硕士

A建投公司工程部基层员工绩效考核体系优化研究

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A建投公司工程部基层员工绩效考核体系优化研究

作者：杨超灿燕山大学

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难加工材料绿色磨削用相变储热复合砂轮的研制

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机械工程学报 2024年第3期60卷 405-414页

作者：赫青山谢永晨崔仲鸣傅玉灿河南工业大学机电工程学院郑州450001 南京航空航天大学机电学院南京210016

高强韧性难加工材料在磨削时容易发生工件表面烧伤,而常规使用磨削液冷却带来的高能耗、环境污染等问题已不容忽视。提出利用沸腾传热和储热技术原理改善砂轮的热学性能实现砂轮对磨削弧区的强化换热,研制了具有高传热系数和较大热容属... 详细信息

高强韧性难加工材料在磨削时容易发生工件表面烧伤,而常规使用磨削液冷却带来的高能耗、环境污染等问题已不容忽视。提出利用沸腾传热和储热技术原理改善砂轮的热学性能实现砂轮对磨削弧区的强化换热,研制了具有高传热系数和较大热容属性的相变储热复合砂轮,并分析了复合砂轮的传热系数和等效热容。设计制作了复合砂轮热学性能分析装置,通过监测多个位置温度变化分析了不同热流密度、工质注入量和散热条件对复合砂轮热学性能的影响,最后进行干磨削高温合金GH4169对比试验。结果表明,复合砂轮的传热系数相对于传统金属基体砂轮可提高2~3倍,工质进入沸腾传热的启动时间在6~15 s,同时增加砂轮热容可以有效减少弧区热量积累以及减缓弧区温升速率;在缓进给深切干磨工艺下使用相变储热复合砂轮的磨削温度在330℃以下,相对于传统砂轮降低了20%。

关键词：磨削超硬磨料砂轮高温合金绿色加工沸腾传热

初中物理交互式微视频开发与应用研究 ——以iSpring Suite为工具

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初中物理交互式微视频开发与应用研究 ——以iSpring Suite为工具

作者：李昆灿海南师范大学

学位级别：硕士

“补肾强骨舒筋方”治疗肝肾亏虚型腰椎间盘突出症的临床研究

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“补肾强骨舒筋方”治疗肝肾亏虚型腰椎间盘突出症的临床研究

作者：王宜灿甘肃中医药大学

学位级别：硕士

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皮肤类器官构建策略的研究进展

中华创伤杂志 2024年第1期40卷 57-64页

作者：张涛崔进苏佳灿海军军医大学第一附属医院创伤骨科上海200433 上海大学转化医学研究院上海200444 上海交通大学医学院附属新华医院骨科上海200092

严重创伤致大面积皮肤缺损发生率高、危害大、治疗困难、预后较差,不仅严重影响患者生活质量,甚至威胁其生命,是临床常见难题。大面积皮肤缺损难以自愈,主要采用皮肤移植等方法进行治疗。自体皮瓣移植来源有限,会对患者造成二次损伤;人... 详细信息

严重创伤致大面积皮肤缺损发生率高、危害大、治疗困难、预后较差,不仅严重影响患者生活质量,甚至威胁其生命,是临床常见难题。大面积皮肤缺损难以自愈,主要采用皮肤移植等方法进行治疗。自体皮瓣移植来源有限,会对患者造成二次损伤;人工皮肤机械完整性差、无法整合,会形成瘢痕,同时也有免疫排斥的风险。皮肤类器官技术能够高度模拟人体皮肤组织及功能,在一定程度上可以弥补目前创面治疗上的不足,为大面积皮肤缺损患者的治疗提供新方法。目前,皮肤类器官的构建方法相对较为成熟,但现有皮肤类器官的结构和功能相对较为单一,与真实的人体皮肤相比还有较大差距,每种构建方法各有利弊,具体哪种构建方法最佳尚无定论。因此,笔者从类器官与皮肤类器官技术及皮肤类器官的构建方法两方面对皮肤类器官构建策略的研究进展进行综述,为构建结构及功能更为复杂的皮肤类器官提供参考。

关键词：皮肤伤口愈合类器官干细胞三维培养