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多重实时荧光PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒方法的建立以及初步应用

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中国动物传染病学报 2015年第1期23卷 1-8页

作者：缪佶鲍衍清邵红霞钱琨秦爱建教育部禽类预防医学省部共建重点实验室扬州225009 扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室扬州225009

本文建立了一种快速、灵敏、特异性强的禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）检测方法，并对REV在鸡胚成纤维细胞（chick embryo fibroblast，CEF）上的增殖动态规律进行研究。分别针对gag、env以及LTR基因的... 详细信息

本文建立了一种快速、灵敏、特异性强的禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）检测方法，并对REV在鸡胚成纤维细胞（chick embryo fibroblast，CEF）上的增殖动态规律进行研究。分别针对gag、env以及LTR基因的保守序列设计3对引物，利用重组质粒作为模板，绘制3种不同基因的标准曲线。检测结果显示，本研究建立了多重实时荧光PCR检测方法，所制备的标准品模板在108~101copies范围内与Ct值之间呈现良好的线性关系，且最低检出量为101copies。REV感染CEF后gag、env、LTR基因的拷贝数均先减少后增多。通过实时荧光PCR技术与间接免疫荧光方法检测，发现REV在CEF上复制的初始阶段呈现病毒适应过程，此后病毒大量复制，表现出明显的增长趋势。该研究不仅为REV的诊断技术提供了一种新的方法，同时也为深入研究REV的感染机制和致病机理奠定了基础。

关键词：禽网状内皮组织增生症病毒鸡胚成纤维细胞实时荧光PCR 复制

流产布鲁菌ppdk基因缺失株的构建及其生物学特性分析

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中国动物传染病学报 2016年第3期24卷 27-34页

作者：高建鹏田明星鲍衍清李朋刘佳萌王少辉丁铲于圣青中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的呈全球性分布的人畜共患细菌性传染病。布鲁菌是一种兼性胞内菌,感染宿主依赖多种基因的表达和调控。近年来,胞内菌的碳代谢与致病力的关系成为研究的热点。前期研究发现碳代谢相关的丙酮酸磷酸双激酶(ppdk... 详细信息

布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的呈全球性分布的人畜共患细菌性传染病。布鲁菌是一种兼性胞内菌,感染宿主依赖多种基因的表达和调控。近年来,胞内菌的碳代谢与致病力的关系成为研究的热点。前期研究发现碳代谢相关的丙酮酸磷酸双激酶(ppdk)基因与布鲁菌毒力相关。本研究利用同源重组方法构建流产布鲁菌ppdk基因缺失株,通过环境压力因子耐受性实验、胞内存活实验和动物致病性实验等探讨ppdk基因对布鲁菌毒力的影响。结果显示,ppdk基因缺失能减弱布鲁菌对多粘菌素B和大牛血清的抵抗性,减弱细菌胞内存活的能力和对小鼠的致病力,表明ppdk基因与流产布鲁菌的毒力密切相关。

关键词：流产布鲁菌 ppdk基因毒力

禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白YxxL基序及其突变体病毒的拯救

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中国家禽 2014年第17期36卷 20-23页

作者：田晓彦范中雷鲍衍清秦爱建邵红霞钱琨叶建强禽类预防医学教育部重点实验室江苏省动物预防医学重点实验室扬州大学兽医学院江苏扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)囊膜蛋白Env与病毒感染、复制、致病性密切相关,然其分子基础尚不清楚。本研究对NCBI中不同REV毒株Env序列分析发现,其胞浆区存在一个高保守且可能与病毒致病性有关的酪氨酸基序YxxL。通过定点突变以及分... 详细信息

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)囊膜蛋白Env与病毒感染、复制、致病性密切相关,然其分子基础尚不清楚。本研究对NCBI中不同REV毒株Env序列分析发现,其胞浆区存在一个高保守且可能与病毒致病性有关的酪氨酸基序YxxL。通过定点突变以及分子传染性克隆技术,构建了REV Env蛋白YxxL基序2个突变体(Y突变为F,L突变为A)。通过转染DF1细胞,并经间接免疫荧光以及测序鉴定,拯救并获得了2个REV突变体病毒,分别命名为FxxL、YxxA。Env蛋白中YxxL保守基序的发现以及相应突变体病毒的拯救为研究REV Env蛋白及其YxxL基序在REV致病中分子作用基础提供了材料。

关键词：禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白 YxxL 定点突变病毒拯救

禽致病性大肠杆菌QseC蛋白的表达及其免疫原性分析

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中国动物传染病学报 2023年

作者：郭伟奇王欣宇王帝胡剑刚张贝贝姚澜王芷洋祁晶晶田明星鲍衍清王少辉李娜新疆农业大学动物医学学院中国农业科学院上海兽医研究所

禽致病性大肠杆菌能够引起禽的大肠杆菌病，对我国养禽业造成严重的经济损失。利用生物信息学方法，分析QseC蛋白的跨膜区域、信号肽、抗原性及亚细胞定位，设计表达引物，以APCE110菌株为模板进行PCR扩增，构建重组表达质粒pColdI-Qse... 详细信息

禽致病性大肠杆菌能够引起禽的大肠杆菌病，对我国养禽业造成严重的经济损失。利用生物信息学方法，分析QseC蛋白的跨膜区域、信号肽、抗原性及亚细胞定位，设计表达引物，以APCE110菌株为模板进行PCR扩增，构建重组表达质粒pColdI-QseC并转化至大肠杆菌感受态BL21（DE3）中诱导蛋白的表达和纯化，重组蛋白QseC与抗QseC小鼠血清和血清型为O1、O2、O78的APEC康复血清进行Western blot试验，检测其免疫原性和反应原性。用C-ImmSim、ClusPro分别进行免疫模拟和蛋白-Toll样受体的分子对接，验证QseC蛋白的免疫效果和蛋白与Toll样受体分子之间的结合模式。结果显示QseC蛋白是细菌的胞质跨膜蛋白，其中膜内区共编码183个氨基酸，膜外区共编码208个氨基酸，氨基酸序列中无信号肽，抗原性为0.5。成功构建表达质粒并在上清中表达，经纯化浓度为0.8 mg/mL。Western blot结果显示，QseC能与抗QseC小鼠血清和不同血清型的APEC康复血清产生特异性条带，表明QseC蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。C-ImmSim免疫模拟显示，在3、10、17日龄进行免疫能够诱导宿主机体产生适应性免疫和记忆免疫，并在25日龄左右抗体效价达到最高值。分子对接结果显示QseC蛋白与TLR2、TLR4和TLR5受体都具有较高的亲和力。本试验成功构建了pColdI-QseC表达质粒并纯化获得QseC蛋白，验证其具有良好的免疫原性和反应原性，同时，与TLR2、TLR4和TLR5受体都具有较高的亲和力。为APEC亚单位疫苗研发提供参考。

关键词：禽致病性大肠杆菌 QseC 免疫原性反应原性

检测大肠杆菌内c-di-GMP水平的双荧光素报告质粒的构建及应用

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微生物学报 2023年第12期63卷 4814-4822页

作者：张贝贝胡剑刚王欣宇郭伟奇姚澜王芷洋王帝祁晶晶田明星鲍衍清王少辉中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

细菌通过调控第二信使环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)而促进其适应环境、存活及致病。【目的】本研究旨在建立有效的c-di-GMP水平检测方法,为大肠杆菌内c-di-GMP水平检测提供便利条件。【方法】根据c-di-GMP核糖开关受体的调... 详细信息

细菌通过调控第二信使环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)而促进其适应环境、存活及致病。【目的】本研究旨在建立有效的c-di-GMP水平检测方法,为大肠杆菌内c-di-GMP水平检测提供便利条件。【方法】根据c-di-GMP核糖开关受体的调控方式、荧光报告基因等设计引物,通过重叠聚合酶链反应(overlap polymerase chain reaction,overlap PCR)和同源重组酶构成基于核糖开关的双荧光素报告质粒pAmCherry-Vc2EGFP(pACVcE),然后构建c-di-GMP代谢基因过表达菌株和缺失菌株,利用pACVcE检测大肠杆菌内c-di-GMP水平。【结果】Overlap PCR扩增产物与目的靶序列一致,测序结果证明pACVcE序列正确。表达c-di-GMP合成酶DgcZ的大肠杆菌胞内c-di-GMP水平显著升高,而表达c-di-GMP降解酶PdeK的大肠杆菌胞内c-di-GMP水平显著降低。禽致病性大肠杆菌的胞内c-di-GMP水平检测发现c-di-GMP降解酶基因pdeK缺失后胞内的c-di-GMP水平显著升高。【结论】本研究构建了基于核糖开关的双荧光素报告质粒,可方便、快速检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平。

关键词：环二鸟苷酸核糖开关双荧光素报告质粒检测

江苏和浙江地区16株鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性分析

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中国动物传染病学报 2023年

作者：王帝王欣宇郭伟奇胡剑刚张贝贝姚澜王芷洋祁晶晶田明星鲍衍清王少辉孙亚伟新疆农业大学动物医学学院中国农业科学院上海兽医研究所

产气荚膜梭菌主要引起鸡的坏死性肠炎，给养鸡业造成严重经济损失，并且该菌产生的孢子能够污染生肉制品而引起人类食源性腹泻，具有重要的公共卫生意义。在减抗限抗大背景下，为了解产气荚膜梭菌的流行及耐药情况，本研究从江苏、浙江... 详细信息

产气荚膜梭菌主要引起鸡的坏死性肠炎，给养鸡业造成严重经济损失，并且该菌产生的孢子能够污染生肉制品而引起人类食源性腹泻，具有重要的公共卫生意义。在减抗限抗大背景下，为了解产气荚膜梭菌的流行及耐药情况，本研究从江苏、浙江等地区养鸡场采集病料，通过选择性培养基、PCR分离鉴定产气荚膜梭菌；并分析产气荚膜梭菌分离株的毒力基因和耐药性。经鉴定，共分离到16 株产气荚膜梭菌分离株，均为A型。对cpa、pfoA、colA、cpb、cpb2、NetB、etx、iap和cpe基因检测结果显示，所有产气荚膜梭菌分离株均含有cpa毒素基因，其中两株分离株含有pfoA毒素基因。药敏检测发现，产气荚膜梭菌分离株对庆大霉素耐药最严重，耐药率为100%，其次为林可霉素、杆菌肽、青霉素、头孢噻肟和头孢吡肟，耐药率都在85%以上。然而，产气荚膜梭菌对磷霉素最为敏感，耐药率为12.5%。结果表明，江苏、浙江地区养鸡场中产气荚膜梭菌主要为A型，耐药性较为严重。

关键词：产气荚膜梭菌分离鉴定毒力基因耐药性

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一例鸭“花肝病”的诊治

中国家禽 2009年第22期31卷 64-64页

作者：闫艳王培永王倩鲍衍清王希徐州铜山禽病门诊部江苏徐州221009 徐州铜山县兽医院江苏徐州221009 扬州大学兽医学院江苏扬州225009

近年来，在广东省广州市郊、南海、花都等地多个番鸭场，发生一种以病死番鸭的肝脏出现花斑样病灶为特征的番鸭病。此病因其肝脏特征性花斑样病变而俗称为“花肝病”。我们对一例疑似花肝病病例进行了实验室诊断。

关键词：花肝病鸭场诊治实验室诊断广州市郊特征性广东省花斑

江苏省部分地区鸡滑液囊支原体的分离鉴定及致病性和耐药性评价

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中国兽医科学 2024年第12期54卷 1617-1626页

作者：赵鹿如祁晶晶张开琴王芷洋叶丽君田明星鲍衍清唐小川王少辉广西大学动物科学技术学院中国农业科学院上海兽医研究所西藏农牧学院动物科学学院

为了探究江苏省部分地区鸡滑液囊支原体（MS）的菌株基因分型及致病性和药物敏感性情况，从江苏省部分地区分离鸡滑液囊支原体，通过菌落观察、玻片凝集试验、16S rRNA测序、vlhA基因PRR区分型等方法，对分离的菌株进行种属及分型鉴定... 详细信息

为了探究江苏省部分地区鸡滑液囊支原体（MS）的菌株基因分型及致病性和药物敏感性情况，从江苏省部分地区分离鸡滑液囊支原体，通过菌落观察、玻片凝集试验、16S rRNA测序、vlhA基因PRR区分型等方法，对分离的菌株进行种属及分型鉴定，同时进行SPF鸡攻毒试验及药敏试验。结果显示，所采集样品中分离出3株疑似MS菌株，均可在固体培养基上生成典型的“油煎蛋”样菌落；经16S rRNA序列分析发现各分离株与MS相似性达99.9%；玻片凝集试验显示其与MS标准阳性血清、MS感染血清有凝集反应，与SPF鸡阴性血清无反应，因此将分离株确定为MS。SPF鸡攻毒试验显示，3株分离株均可引起鸡只明显的关节、足垫肿大以及轻微气囊炎症状，其中关节攻毒组症状最为明显。MIC测定结果显示，与标准株MS WVU1853相比，这3株分离株对替米考星和恩诺沙星的敏感性显著降低，对泰乐菌素、吉他霉素、泰妙菌素、林可霉素、氟苯尼考及大观霉素敏感性出现不同程度降低；对盐酸沃尼妙林、多西环素、土霉素和泰万菌素具有较高敏感性。本研究为当地防控MS感染提供了科学依据，为临床MS的分离鉴定及用药选择提供了方法指导，为MS疫苗评估中攻毒模型的建立奠定了研究基础。

关键词：滑液囊支原体分离鉴定 vlhA基因分型致病性药物敏感性

产NDM-1型碳青霉烯酶奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析

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中国兽医科学 2023年第12期53卷 1554-1562页

作者：王芷洋彭浩恒郭伟奇王帝张贝贝王欣宇胡剑刚祁晶晶田明星鲍衍清李海花王少辉天津农学院动物科学与动物医学学院、天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300384 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

由金属β-内酰胺酶介导的耐碳青霉烯类抗生素的细菌在全球范围内蔓延,blaNDM-1是其中典型且关键的一种。奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)广泛分布于自然环境以及哺乳动物肠道内,可携带多种耐药基因,有潜在的人畜共患风险。为了调查奇... 详细信息

由金属β-内酰胺酶介导的耐碳青霉烯类抗生素的细菌在全球范围内蔓延,blaNDM-1是其中典型且关键的一种。奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)广泛分布于自然环境以及哺乳动物肠道内,可携带多种耐药基因,有潜在的人畜共患风险。为了调查奇异变形杆菌在养禽场内的耐药情况,本研究从浙江、江苏等地采集病料,通过选择性培养基分离、生化实验、PCR方法鉴定奇异变形杆菌,分析分离株的耐药性,根据耐药性结果检测产碳青霉烯酶耐药基因的携带情况,最后对产NDM-1型碳青霉烯酶分离株进行全基因组测序分析。经过选择性培养基分离、生化实验及PCR检测共鉴定到10株奇异变形杆菌,药物敏感性结果显示,分离株PM01对氟苯尼考、复方新诺明、硝基呋喃、头孢菌素类抗生素耐药,且对碳青霉烯类抗生素耐药;PCR检测显示,PM01株携带blaNDM-1耐药基因。全基因组测序发现blaNDM-1基因位于染色体中,通过线性比对分析显示其与人源大肠杆菌以及肺炎克雷伯菌共享相似的遗传背景。研究结果表明,携带blaNDM-1的奇异变形杆菌可能会导致肠杆菌科细菌间碳青霉烯类耐药性的传播,具有潜在的公共卫生学意义。

关键词：奇异变形杆菌碳青霉烯酶耐药性全基因组测序