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结核疫苗优势抗原ESAT6、CFP10的分子生物学基础及应用研究进展

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生物医学工程学杂志 2012年第2期29卷 392-396页

作者：范琴(综述) 鲍朗(审校) 四川大学华西医学中心感染免疫研究室成都610041

早期分泌抗原靶分子6(ESAT6,后简称E6)和培养滤液蛋白10(CFP10,后简称C10)因能诱导宿主产生强烈细胞免疫应答,成为新型结核(TB)疫苗的热门优势抗原,在TB的预防、诊断等领域具有广阔的应用前景。本文汇集国际最新进展,从E6、C10的结构-... 详细信息

早期分泌抗原靶分子6(ESAT6,后简称E6)和培养滤液蛋白10(CFP10,后简称C10)因能诱导宿主产生强烈细胞免疫应答,成为新型结核(TB)疫苗的热门优势抗原,在TB的预防、诊断等领域具有广阔的应用前景。本文汇集国际最新进展,从E6、C10的结构-功能、生物学特性、表达-分泌、宿主免疫及疫苗研究等全新视角对其进行分析与展望。

关键词：早期分泌抗原靶分子6 培养滤液蛋白10 结构-功能分泌调控免疫机制结核疫苗

基因芯片技术对赖型钩端螺旋体溶血素基因体内诱导差异表达的研究

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四川大学学报（医学版） 2012年第4期43卷 520-524页

作者：赵辉鲍朗四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室成都610041

目的探讨经宿主体内环境诱导前后赖型钩端螺旋体溶血素致病基因表达的差异。方法以赖型钩端螺旋体56601株的染色体DNA为模板,PCR扩增出溶血素基因片段为探针,并通过VersArray Chipwriter系统构建基因芯片。提取感染宿主前后钩端螺旋体R... 详细信息

目的探讨经宿主体内环境诱导前后赖型钩端螺旋体溶血素致病基因表达的差异。方法以赖型钩端螺旋体56601株的染色体DNA为模板,PCR扩增出溶血素基因片段为探针,并通过VersArray Chipwriter系统构建基因芯片。提取感染宿主前后钩端螺旋体RNA,逆转录为cDNA,用随机引物PCR扩增,以HEX和CY5双色荧光标记并与基因芯片进行杂交,使用Genepix 4000B扫描仪扫描芯片,通过检测芯片上的荧光信号比值来研究钩端螺旋体溶血素基因在宿主体内的表达情况。结果成功构建赖型钩端螺旋体56601株溶血素基因芯片,芯片检测发现在宿主感染后钩体溶血素基因LA1029(Ratio=0.65)、LA1027(Ratio=0.53)具有明显上调表达(Ratio1.5),而LA4004的表达在宿主肝脏中要明显低于血液中(Ratio=0.67);LA3937(Ratio=2.28)和LA1029(Ratio=2.20)在宿主肾脏中的表达要明显高于血液中(Ratio>1.5)。结论钩体溶血素基因的体内外表达和不同器官间的表达存在差异,这些差异表达的溶血素基因及产物在钩体病的致病中可能起重要的作用。

关键词：钩端螺旋体溶血素基因芯片差异表达

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钩端螺旋体的DNA研究进展

中国人兽共患病杂志 1990年第5期6卷 42-44,29页

作者：鲍朗戴保民华西医科大学钩体研究室

钩端螺旋体(下称钩体)DNA探索性研究工作起始于60年代末期。美国乔治敦大学Haapala等用冷酚法提取在培养过程中加入~3H胸腺嘧啶核苷的数株钩体DNA,利用热解链温度(T_m)曲线和浮力密度法(Buoyanty density)确定其硷基配对组成(G+C),并... 详细信息

钩端螺旋体(下称钩体)DNA探索性研究工作起始于60年代末期。美国乔治敦大学Haapala等用冷酚法提取在培养过程中加入~3H胸腺嘧啶核苷的数株钩体DNA,利用热解链温度(T_m)曲线和浮力密度法(Buoyanty density)确定其硷基配对组成(G+C),并通过标记在DNA上的~H测定特异性核双倍体形成,以了解其遗传相关性。结果表明,致病钩体根据其G+C百分率可分为两组,同组钩体DNA有很高程度的遗传相关性,而组间钩体则几乎缺如。从而提出,钩体DNA的组成可能与其生物学特性有某种关系。

关键词：钩端螺旋体 DNA

人IL-12与结核分枝杆菌抗原ESAT-6联合基因疫苗的免疫效果观察

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微生物学报 2007年第3期47卷 477-481页

作者：郝牧鲍朗高蕾四川大学华西医学中心基础与法医学院感染免疫研究室成都610041

人白细胞介素12（IL-12）与结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达质粒联合基因免疫,诱导免疫应答效果观察.近交系BALB/c小鼠,随机分组：A组（生理盐水对照）、B组（pcDNA3.1空质粒对照）、C组（BCG对照）、D组（pcESAT-6）和E组（pcI... 详细信息

人白细胞介素12（IL-12）与结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达质粒联合基因免疫,诱导免疫应答效果观察.近交系BALB/c小鼠,随机分组：A组（生理盐水对照）、B组（pcDNA3.1空质粒对照）、C组（BCG对照）、D组（pcESAT-6）和E组（pcIL-12＋pcESAT-6）.B、D、E质粒免疫组小鼠分别于胫前肌肌肉注射布比卡因（7.5g/L）和质粒的混和物（1：4,100μL,含质粒70μg/次）,A组小鼠肌肉注射生理盐水和布比卡因的混和物（1：4,100μL）,均间隔2周免疫一次,共免疫3次;末次免疫时,C组小鼠皮下注射BCG菌液,0.3mL/只,含10^6CFU/mL.末次免疫后14d和28d,各组小鼠分别取血分离血清用于总IgG测定,同时分离脾细胞,经TB-PPD刺激后检测脾细胞增殖（XTT比色法）活性和脾细胞培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）、白介素4（IL-4）分泌水平.pcESAT-6质粒DNA单独免疫（D组）或与pcIL-12质粒DNA联合免疫（E组）,均能诱导小鼠产生特异性抗体,且抗体水平在末次加强免疫后14～28d逐渐增加;但pcIL-12与pcESAT-6联合免疫后,特异性抗体水平较pcESAT-6单独免疫增加不明显（P＜0.05）.c、D、E组免疫小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,E组小鼠特异性淋巴细胞增殖活性和IFN-γ分泌水平明显强于C组和D组（P＜0.05）,而IL-4分泌水平相互间未发现明显差异.末次加强免疫后14～28d,E组小鼠脾细胞增殖活性维持在较高水平,而C组小鼠脾细胞增殖活性先低后高,D组则先高后低;IFN-γ诱生水平,E组最高,C组次之,D组最低.pcIL-12与pcESAT-6质粒DNA联合免疫后能刺激机体产生强烈的细胞免疫和稳定的体液免疫,在动物体内诱发的细胞免疫较ESAT-6或BCG单独免疫时均有明显增加并维持较长时间,此外联合免疫后诱导的体液免疫也较BCG免疫有明显增加.

关键词：白细胞介素12 结核分枝杆菌 ESAT-6 DNA疫苗

结核分枝杆菌毒力分泌基因Rv3872重组卡介苗的构建及表达

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第6期26卷 539-542页

作者：时欣欣鲍朗邱云青郭思四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室四川成都610041 北京市结核病胸部肿瘤研究所北京101100

目的:构建结核分枝杆菌Rv3872的原核重组表达质粒pET-3872并对其进行表达及鉴定。构建表达结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3872即PE35的重组卡介苗。方法:应用PCR技术扩增Rv3872基因,定向克隆入pET32a(+)并转化*** BL21(DE3)菌株,测序后用IPTG... 详细信息

目的:构建结核分枝杆菌Rv3872的原核重组表达质粒pET-3872并对其进行表达及鉴定。构建表达结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3872即PE35的重组卡介苗。方法:应用PCR技术扩增Rv3872基因,定向克隆入pET32a(+)并转化*** BL21(DE3)菌株,测序后用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测及鉴定。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。构建重组穿梭表达质粒pMV-3872,将重组质粒电穿孔进入卡介苗,对重组卡介苗进行诱导表达用SDS-PAGE和Western blot检测和鉴定目的蛋白。结果:表达融合蛋白的pET-3872质粒构建成功,重组蛋白经Western blot检测出特异性阳性信号。重组卡介苗BCG-3872构建成功,热诱导表达后经SDS-PAGE和Western blot,在培养上清中检测到目的蛋白。结论:成功构建了重组质粒pET32a(+),并在大肠杆菌中表达了PE35蛋白,有利于进一步研究Rv3872基因功能。本研究还对表达结核分枝杆菌蛋白PE35的重组卡介苗进行了鉴定,为进一步研究该重组卡介苗的免疫功能奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 Rv3872基因表达重组卡介苗

致病性钩端螺旋体微量DNA的聚合酶链反应(PCR)

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中国人兽共患病杂志 1990年第6期6卷 2-4页

作者：鲍朗戴保民华西医科大学钩端螺旋体病研究室

本研究首次通过对黄疸出血群钩端螺旋体 DNA 的分子克隆的反复筛选,获得了两个重组DNA片段,其中一个具有广泛针对各群致病性钩体的特性,另一个仅对黄疸出血群钩体起杂交反应。经 DNA 序列分析,分别合成两对 PCR 寡核苷酸引物——Primer ... 详细信息

本研究首次通过对黄疸出血群钩端螺旋体 DNA 的分子克隆的反复筛选,获得了两个重组DNA片段,其中一个具有广泛针对各群致病性钩体的特性,另一个仅对黄疸出血群钩体起杂交反应。经 DNA 序列分析,分别合成两对 PCR 寡核苷酸引物——Primer B1.2和 Primer B3.4。本研究证明 PCR 是一种灵敏度极高,针对性很强的 DNA 检测技术,可用于钩体病早期诊断和流行病学分类鉴定。

关键词：钩端螺旋体 DNA 分子克隆 PCR

钩端螺旋体黄疸出血群基库构建,重组DNA探针及序列分析...

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中华微生物学和免疫学杂志 1990年第5期10卷 277-281页

作者：鲍朗代保民

利用基因芯片对赖型钩体毒力基因差异表达与致病相关性的探讨

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四川大学学报（医学版） 2015年第1期46卷 11-15页

作者：余德立鲍朗四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室成都610041

目的通过对连续动物传代和试管培养的赖型钩端螺旋体部分致病基因表达差异性的检测,分析赖型钩端螺旋体特异性基因表达与毒力改变之间的联系,了解赖型钩端螺旋体致病过程和发病机制。方法将27只豚鼠分为3组(n=9),分别经腹部皮下接种1mL... 详细信息

目的通过对连续动物传代和试管培养的赖型钩端螺旋体部分致病基因表达差异性的检测,分析赖型钩端螺旋体特异性基因表达与毒力改变之间的联系,了解赖型钩端螺旋体致病过程和发病机制。方法将27只豚鼠分为3组(n=9),分别经腹部皮下接种1mL体内培养钩体(体内培养组)、体外培养钩体(体外培养组)或钩体培养基(培养基组),接种钩体浓度为108/mL并处于对数生长期。在接种后15d内观察其发病和死亡状况,测量其体温体质量变化情况,并于接种后第15d将存活豚鼠处死,测量脏器系数,了解经不同环境培养的钩体的毒力情况;以赖型钩端螺旋体标准株DNA为模板,采用PCR技术扩增出所选特定基因作为探针,使用点样仪进行芯片点样。分别提取经豚鼠体内连续数代培养的钩端螺旋体RNA与EMJH培养基中培养的钩端螺旋体RNA,逆转录后分别使用Cy5和Cy3进行荧光标记,并与基因芯片进行杂交。扫描后通过分析两种荧光强度的比值,了解赖型钩端螺旋体相关毒力基因的差异表达情况。结果接种后,体内培养组豚鼠存活率为0%,体外培养组豚鼠存活率为88.9%,培养基组豚鼠全部存活;体内培养组豚鼠较其余两组豚鼠体温升高(P<0.05)、体质量下降(P<0.05);体内培养组豚鼠心、肺、肾的脏器系数较体外培养组及培养基组豚鼠更大(P<0.05);解剖后,体内培养组豚鼠肺部出血情况较其余两组更为严重;通过基因芯片,检测到溶血素基因以及其他与钩体生存致病能力相关的基因呈现出不同程度的改变,溶血素基因LA1027、LA1029、LA4004、LA3050、LA3540、LA0327、LA0378、LA1650、LA3937、O抗原连接酶基因LA2089、鞭毛动力蛋白基因LA3576、外膜蛋白基因LA0011及Loa22基因上调。结论赖型钩体经连续体内培养后毒力增高,钩体毒力变化与其基因表达差异存在联系,了解这些基因的变化意义对阐明钩体的致病机制有重要意义。

关键词：钩端螺旋体基因芯片差异表达毒力基因溶血素

聚合酶链反应检测致病性钩端螺旋体微量DNA的研究

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华西医科大学学报 1990年第3期21卷 225-229页

作者：鲍朗戴保民华西医大钩端螺旋体病研究室

作者通过对黄疸出血群钩端螺旋体DNA的分子克隆和筛选,获得了两个重组DNA片段,其中一个具有广泛针对各群致病性构体的特性,另一个仅对黄疸出血群钩体起杂交反应。经DNA序列分析和限制性谱测定,分别合成两对聚合酶链反应寡核苷酸引物—... 详细信息

作者通过对黄疸出血群钩端螺旋体DNA的分子克隆和筛选,获得了两个重组DNA片段,其中一个具有广泛针对各群致病性构体的特性,另一个仅对黄疸出血群钩体起杂交反应。经DNA序列分析和限制性谱测定,分别合成两对聚合酶链反应寡核苷酸引物——引物B1、2和引物B3、4。以该引物对各群、型钩体微量DNA(0.1 ng)行聚合酶链扩增反应,引物B1、2能引导扩增全部致病性钩体DNA,引物B3、4则特异性地扩增黄疸出血群钩体DNA,非致病性钩体和其他微生物DNA均无扩增反应。结果表明,聚合酶链反应是一种灵敏度极高、针对性很强的DNA扩增技术,可用于钩体病早期诊断和流行病学分类鉴定。

关键词：钩端螺旋体 DNA 聚合酶链反应