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Gprasp2基因缺陷耳聋小鼠模型的构建及表型鉴定

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Gprasp2基因缺陷耳聋小鼠模型的构建及表型鉴定

反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响

2018中国遗传学会第十次全国会员代表大会暨学术讨论会

作者：鲁雅洁魏钦俊姚俊陈智斌邢光前曹新南京医科大学基础医学院医学遗传学系江苏省异种移植重点实验室南京医科大学基础医学院基础医学实验教学中心南京医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科

X连锁遗传性耳聋家系极为罕见,相比于其他孟德尔遗传方式,其相关的耳聋致病基因报道也数目极少。G蛋白偶联受体相关分选蛋白2（G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2）是本课题组首次鉴定的X-连锁隐性遗传... 详细信息

X连锁遗传性耳聋家系极为罕见,相比于其他孟德尔遗传方式,其相关的耳聋致病基因报道也数目极少。G蛋白偶联受体相关分选蛋白2（G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2）是本课题组首次鉴定的X-连锁隐性遗传综合征型耳聋（Syndromic hearing loss,SHL）的致病基因,也是迄今报道的第二个该遗传方式的致聋基因。GPRASP2是GPRASPs家族成员之一,能够与几种G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）,包括M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体和降钙素受体相互作用,调节其活性。以往研究提示GPCRs以及GASPs功能异常主要与神经系统疾病、肿瘤以及免疫炎症等疾病的发生相关,与听觉功能相关性的研究迄今尚未见报道。本研究拟在前期工作的基础上,首先通过CRISPR/Cas9技术,设计靶向与人GPRASP2直系同源的小鼠Gprasp2基因的sgRNAs,通过显微注射C57B6/J小鼠胚胎,从而构建Gprasp2基因缺陷的小鼠动物模型。进一步通过定量PCR、免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）鉴定Gprasp2基因的敲除效率;应用听性脑干诱发点位（Auditory brainstem response, ABR）、声音信号恐惧测试方法检测基因敲除小鼠的听力表型;应用核磁共振（magnetic resonance imaging, MRI）观察基因缺陷型小鼠内耳结构变化;HE染色切片观察、免疫荧光铺片激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscopy,LSCM）和扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）观察小鼠耳蜗基底膜毛细胞超微结构变化;最后通过旷场实验（Open field test, OFT）、新奇抑制摄食实验（Novelty suppressed-feeding, NSF）、蔗糖偏好测试（Sucrose preference test, SPT）、悬尾实验（Tail suspension test, TST）和强迫游泳实验（Forced swimming test, FST）方法检测小鼠的行为学变化。结果表明,通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Gprasp2基因缺陷型小鼠,定量PCR和IHC均显示小鼠的耳蜗组织中Gprasp2表达缺陷。ABR和声音信号恐惧测试结果提示Gprasp2缺陷小鼠听阈显著升高,且对噪声和纯音刺激反应不敏感。MRI结果显示其耳蜗基底回与内耳道底部不完全分离。内耳耳蜗毛细胞的电镜观察显示Gprasp2缺陷小鼠的内耳毛细胞超微结构异常,且排列紊乱。此外,行为学检查结果还提示Gprasp2缺陷型小鼠与野生型小鼠相比呈现明显的兴奋效应,提示Gprasp2基因缺陷除导致耳聋表型外,还可能参与调节神经系统相关信号通路,从而影响个体的行为学变化。本研究成功构建了Gprasp2基因缺陷型耳聋小鼠,为进一步探索Gprasp2基因致聋的分子机制提供了重要的动物模型。

关键词： X连锁遗传综合征型耳聋 Gprasp2 耳蜗动物模型

来源： cnki会议评论

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山西医科大学学报 2010年第3期41卷 205-209,240页

作者：孙荣斌鲁雅洁魏钦俊南京医科大学药学院南京210029 南京医科大学基础医学院生物技术系

目的构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响。方法应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMT1反义RNA真核表达质粒,测... 详细信息

目的构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响。方法应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMT1反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染入人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化。结果成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒。转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加。结论反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标。

关键词： DNMT1基因反义RNA 乳腺癌 MDA-MB-435s

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医学院校生物技术专业实践教学新模式的探索

基础医学教育 2017年第9期19卷 684-686页

作者：姚俊魏钦俊鲁雅洁曹新南京医科大学基础医学院生物技术系南京211166

文章论述了构建医学院校生物技术专业人才培养模式的思路,提出新形势下生物技术人才的培养必须顺应社会需求,合理定位,体现特色,强化实践。在教学实践中确立了"点、线、面至立体"的递进式实践教学新体系,并对该教学体系下的人才培养模... 详细信息

文章论述了构建医学院校生物技术专业人才培养模式的思路,提出新形势下生物技术人才的培养必须顺应社会需求,合理定位,体现特色,强化实践。在教学实践中确立了"点、线、面至立体"的递进式实践教学新体系,并对该教学体系下的人才培养模式进行了深入探讨。

关键词：生物技术专业实验教学人才培养

致聋基因EYA4在斑马鱼胚胎发育中的时空表达特征分析

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山东大学耳鼻喉眼学报 2019年第3期33卷 49-55页

作者：钱方舟黄啸博魏钦俊陈智斌南京医科大学第一附属医院江苏省人民医院耳鼻咽喉科江苏南京210029 江阴市人民医院耳鼻咽喉科江苏无锡214400 南京医科大学基础医学院医学遗传学系江苏南京211166

目的研究致聋基因EYA4在斑马鱼胚胎发育不同时期的表达及其定位,为进一步利用斑马鱼模型探索其可能的致病机制奠定基础。方法利用生物信息学分析斑马鱼与人EYA4基因的同源性,同时通过整胚原位杂交和半定量PCR分析斑马鱼eya4基因在早期6... 详细信息

目的研究致聋基因EYA4在斑马鱼胚胎发育不同时期的表达及其定位,为进一步利用斑马鱼模型探索其可能的致病机制奠定基础。方法利用生物信息学分析斑马鱼与人EYA4基因的同源性,同时通过整胚原位杂交和半定量PCR分析斑马鱼eya4基因在早期64细胞胚胎、oblong-sphere、50%-epiboly、15-somite、24hpf、36hpf、48hpf、60hpf、72hpf和1周的时空表达分析。结果生物信息学分析显示斑马鱼eya4与人EYA4基因高度同源。半定量PCR结果显示斑马鱼eya4在胚胎发育早期(64细胞~50%-epiboly)不表达,15-somite期逐渐开始表达并于24~48hpf达到高峰,此后表达水平稍降低并维持在一定水平。全胚原位杂交检测结果显示eya4在斑马鱼64-细胞,oblong-sphere和50%-epiboly时期均未表达,提示该基因为非母源性表达,在15-somite期开始出现可检测的表达,24~48hpf期表达水平达到顶峰,并且在头部神经系统、听囊内耳毛细胞和侧线系统中均有表达,至60hpf^1-week期表达水平减弱并维持稳定在一定水平。结论斑马鱼eya4与人致聋基因EYA4具有高度同源性,通过研究eya4在斑马鱼胚胎早期发育中的时空表达模式,可为后续利用斑马鱼作为动物模型深入研究人类EYA4在胚胎发育中的作用及其突变致聋机制奠定重要的实验基础。

关键词： EYA4基因斑马鱼胚胎发育整胚原位杂交时空表达

特大常染色体显性遗传聋家系听力学特征及候选致病基因突变筛查

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中华耳科学杂志 2011年第4期9卷 417-422页

作者：陈睿春刘丞魏钦俊鲁雅洁卢新红曹新邢光前南京医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科南京210029 南京医科大学生物技术系南京210029

目的探讨一中国常染色体显性遗传聋大家系的听力学特征,进行已知致聋基因已知突变位点的筛查。方法经知情同意,对家系成员进行全身检查及听力学检测,获得血样标本;整理分析家系资料并绘制系谱图;用基因组DNA抽提试剂盒提取外周血DNA。对... 详细信息

目的探讨一中国常染色体显性遗传聋大家系的听力学特征,进行已知致聋基因已知突变位点的筛查。方法经知情同意,对家系成员进行全身检查及听力学检测,获得血样标本;整理分析家系资料并绘制系谱图;用基因组DNA抽提试剂盒提取外周血DNA。对2例家系患者DNA进行GJB2和GJB3基因全部编码区突变检测,对其余23个已知常染色体显性遗传性耳聋(DFNA)基因的74个已知突变位点所涉及的50个外显子进行PCR扩增和直接测序分析。结果该家系共7代199人,现存4代176人,耳聋患者54人。系谱分析显示,耳聋表型代代相传,男女患病人数分别为24和30,符合常染色体显性遗传特征。听力学表现为:迟发性、进行性、双侧对称性、感音神经性听力损失,首先是高频区受损,并快速向中、低频扩展。GJB2、GJB3基因全部编码区及其余23个DFNA基因已知突变位点的序列分析均无阳性发现。结论该家系是一个非综合征型常染色体显性遗传聋大家系,耳聋表型为迟发性、进行性、双耳对称性感音神经性听力损失;初步分子遗传学分析提示可能由新基因或已知基因的新突变致病。

关键词：常染色体显性遗传耳聋家系基因突变

耳聋基因GJB3c．538C〉T突变致病性效应的初步研究

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医学分子生物学杂志 2013年第1期10卷 10-15页

作者：王帅魏钦俊范燚鲁雅洁邢光前曹新南京医科大学基础医学院南京市210029 南京医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科南京市210029

目的对人GJB3基因c．538C〉T点突变进行生物信息学及功能分析，预测并验证其致病性。方法聚合酶链反应扩增含GJB3基因c．538C〉T突变的编码区全序列，DNA测序验证后与T载体连接，再通过重组DNA技术，将GJB3基因编码区全序列导入pEGFP—N... 详细信息

目的对人GJB3基因c．538C〉T点突变进行生物信息学及功能分析，预测并验证其致病性。方法聚合酶链反应扩增含GJB3基因c．538C〉T突变的编码区全序列，DNA测序验证后与T载体连接，再通过重组DNA技术，将GJB3基因编码区全序列导入pEGFP—N1载体，构建了GJB3基因野生型（***31-wT）和突变型（***31-R180X）表达载体，验证并纯化后，分别转染人胚肾HEK293细胞，观察EGFP-Cx31融合蛋白在细胞内定位表达情况。通过生物信息学方法分析c．538C〉T突变前后。Cx31蛋白的三维空间结构和平均势能变化。结果细胞内荧光定位结果显示GJB3c．538C〉T突变后，Cx31蛋白只于胞内表达，未能正常形成细胞间隙连接结构。而生物信息学分析结果也表明突变后Cx31蛋白的三维空间结构和Anolea原子平均势能均发生了明显变化。结论GJB3基因c．538C〉T点突变导致其编码的Cx31蛋白的结构与功能发生变化，可能通过影响细胞间隙连接的形成，从而导致遗传性耳聋的发生。

关键词：耳聋 GJB3基因突变致病性

165例聋人耳聋基因诊断结果分析及婚配生育指导

维普期刊数据库评论

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维普期刊数据库

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中国计划生育学杂志 2014年第11期22卷 773-774页

作者：王荷溪潘蓉蓉戴晓云魏钦俊康东洋江苏省镇江市计划生育指导所 212004 南京医科大学生物技术系解放军总医院耳鼻咽喉研究所

我国是出生缺陷和残疾高发国家,出生缺陷总发生率40‰～ 60‰.残疾人群有8296万,其中听力残疾人群有2780万（33％）,居各类残疾之首[1-2].研究表明,中国耳聋人群中,GJB2、SLC26A4及线粒体基因（mtDNA12Sr RNA）是导致大部分遗传性耳聋... 详细信息

我国是出生缺陷和残疾高发国家,出生缺陷总发生率40‰～ 60‰.残疾人群有8296万,其中听力残疾人群有2780万（33％）,居各类残疾之首[1-2].研究表明,中国耳聋人群中,GJB2、SLC26A4及线粒体基因（mtDNA12Sr RNA）是导致大部分遗传性耳聋发生的三大责任基因,所占比例分别约为21％、14.5％及3.8％,由此催生出的耳聋基因诊断技术在中国已成为耳聋病因学分析的有力工具,并常规应用于临床检测[3].目前中国耳聋人群中约66％的遗传性耳聋已能够得到明确诊断.

关键词：基因诊断技术遗传性耳聋生育指导 SLC26A4 听力残疾婚配聋人出生缺陷

GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

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南京医科大学学报（自然科学版） 2021年第1期41卷 4-10页

作者：张敏姚俊鲁雅洁王红顺王盈杨海元魏钦俊曹新戴一凡南京医科大学医学遗传学系江苏南京211166 南京医科大学江苏省异种移植重点实验室江苏南京211166

目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF),为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法:采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以p X330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果:生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论:人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。

关键词： GPRASP2 CRISPR/Cas9 猪胎儿成纤维细胞 GPRASP2基因敲除细胞系

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一遗传性听神经病家系的听力学表型特征

南京医科大学学报（自然科学版） 2007年第4期27卷 322-325页

作者：陈智斌邢光前曹新田慧琴李晓璐魏钦俊卜行宽南京医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科江苏南京210029 南京医科大学生物技术学系江苏南京210029

目的:探讨一个遗传性听神经病家系的听力学特征。方法:对23名家系成员(直系亲属21人,配偶2人)进行病史采集、体格检查及系统的听力学检测,包括纯音测听、声导抗、听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)、耳蜗微音器电位(cochle... 详细信息

目的:探讨一个遗传性听神经病家系的听力学特征。方法:对23名家系成员(直系亲属21人,配偶2人)进行病史采集、体格检查及系统的听力学检测,包括纯音测听、声导抗、听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)、耳蜗微音器电位(cochlear microphonics,CMs)及诱发性耳声发射(evoked otoacoustic emissions,EOAEs)。对其中2名患者进行纯音听力随访。结果:7名家系成员符合听神经病诊断。其中6人于9岁前发病,1￣2年内快速发展为重度聋;纯音测听为双耳对称的重度￣极重度感音神经性听力损失,高频下降型曲线;镫骨肌反射及ABR引不出,而CMs、EOAEs正常或基本正常。1例无听力障碍主诉,言语识别率正常;纯音测听显示双耳对称的轻度高频感音神经性听力损失,镫骨肌反射及ABR引出,EOAEs及CMs正常。2例患者纯音测听随访显示听力损失进行性加重。所有患者无耳聋外表现。结论:该听神经病家系的听力学表型特征是:非综合征型、双侧对称性、高频下降为主的感音神经性听力损失,患者可表现为早年发病并快速进展的重度￣极重度耳聋,或成年后发病并缓慢进展的轻度听力下降。

关键词：听神经病听力学遗传性耳聋家系