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非活性人细胞依赖型血型抗原的研究及应用

中国免疫学杂志 2015年第2期31卷 274-276,281页

作者：丁少华蒙青林魏双施李勇中科院苏州生物医学工程技术研究所苏州215163

长期以来,在医学临床常规的血型抗体检测工作中存在抗原缺乏的困难,由于对活性细胞的依赖,使得血型相容性检测技术落后于临床上同种异型免疫性疾病的诊断、治疗的需求[1]。近年来人们已经对绝大多数血型抗原编码基因、抗原分子以及抗原... 详细信息

长期以来,在医学临床常规的血型抗体检测工作中存在抗原缺乏的困难,由于对活性细胞的依赖,使得血型相容性检测技术落后于临床上同种异型免疫性疾病的诊断、治疗的需求[1]。近年来人们已经对绝大多数血型抗原编码基因、抗原分子以及抗原载体的组成和结构等都有了十分清楚的认识,不依赖活性人血液细胞的血型抗原的研究成为血液免疫学领域的重点研究方向之一,目前主要研究项目有：1重组表达血型抗原;2化学合成血型抗原多肽;3适配体技术筛选的血型模拟抗原；4纳米磁珠细胞膜抗原等。

关键词：血型抗原抗原编码基因同种异型依赖型血液细胞免疫性疾病抗原载体谱细胞相容性膜抗原

重组鸡IFN-α的高效表达与一步复性和纯化

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中国兽医科学 2010年第4期40卷 415-420页

作者：魏双施王艺萌王巍孙仰峰王君伟东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

通过在线网站以及生物学软件分析,将天然鸡IFN-α基因中的稀有密码子同义替换为大肠杆菌偏好的密码子。优化后的基因经人工合成后与温控型表达载体pWL连接并转入大肠杆菌中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达产物的分子质量约为19 ku,表... 详细信息

通过在线网站以及生物学软件分析,将天然鸡IFN-α基因中的稀有密码子同义替换为大肠杆菌偏好的密码子。优化后的基因经人工合成后与温控型表达载体pWL连接并转入大肠杆菌中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达产物的分子质量约为19 ku,表达量占总蛋白的28.3%。表达产物主要以包涵体形式存在,用高浓度变性剂溶解后,采用Sephadex G50凝胶过滤一步复性并纯化重组鸡IFN-α,纯度可达98%以上。每1 L培养基可以得到47.1 mg的重组鸡IFN-α,产出率达34.14%。表达的重组鸡IFN-α在CEF/NDV检测系统上的比活性为1.12×108U/mg。

关键词：鸡 α-干扰素基因优化一步法复性和纯化

AAV介导的RNAi对SARS-CoV-2 S基因表达的抑制作用

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生物技术通报 2022年第3期38卷 188-193页

作者：刘晓玫王东鑫张春魏双施中国科学院生物医学检验技术重点实验室中国科学院苏州生物医学工程技术研究所苏州215163

旨在研究AAV介导shRNA在体内、体外特异性抑制SARS-CoV-2 S基因的表达,为抑制SARS-CoV-2感染提供参考。设计了7条靶向SARS-CoV-2 S基因的shRNA,分别构建了shRNA1-7的质粒表达载体,与S基因表达载体共同转染体外培养细胞,通过qRT-PCR和Wes... 详细信息

旨在研究AAV介导shRNA在体内、体外特异性抑制SARS-CoV-2 S基因的表达,为抑制SARS-CoV-2感染提供参考。设计了7条靶向SARS-CoV-2 S基因的shRNA,分别构建了shRNA1-7的质粒表达载体,与S基因表达载体共同转染体外培养细胞,通过qRT-PCR和Western blot分析其对S基因表达的抑制作用,筛选出抑制效率最高的shRNA1;构建包装表达shRNA1的重组腺相关病毒(rAAV)载体,将rAAV-shRNA1与S基因表达质粒共同转导293T细胞,S基因表达的抑制率为65.6%;两者通过滴鼻或肌肉注射方式共同转导小鼠,qRT-PCR检测其在体内对S基因表达的抑制率分别为36.8%和90.3%。

关键词：新型冠状病毒刺突蛋白 RNA干扰腺相关病毒

鹅IgA重链恒定区的原核表达及其多克隆抗体的制备

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黑龙江畜牧兽医 2013年第12期 107-110页

作者：盛巧玲郭永丽魏双施王璞高明春王君伟东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

为了研究鹅免疫球蛋白的生物学功能,试验采用PCR技术,参考鹅IgA重链恒定区(F)基因序列设计引物,扩增出F基因,构建了含有F基因的重组原核表达质粒pET-28a-GoIgA-C,目的基因为1 339 bp,再进行IPTG诱导表达、ELISA检测和Western-blot分析... 详细信息

为了研究鹅免疫球蛋白的生物学功能,试验采用PCR技术,参考鹅IgA重链恒定区(F)基因序列设计引物,扩增出F基因,构建了含有F基因的重组原核表达质粒pET-28a-GoIgA-C,目的基因为1 339 bp,再进行IPTG诱导表达、ELISA检测和Western-blot分析。结果表明:获得了F的重组蛋白,分子质量约为50 ku,切胶纯化并以其为免疫原制备了多克隆抗体,抗体效价在1∶25 600以上;制备的多克隆抗体具备与鹅IgA反应的性质,与人、猪、牛和鸡免疫球蛋白均不发生反应。说明试验成功获得了F重组蛋白及小鼠多克隆抗体。

关键词：鹅IgA重链恒定区基因原核表达多克隆抗体

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鹅IFN-α基因的高效表达

中国兽医科学 2009年第7期39卷 636-640页

作者：王巍孙仰峰魏双施李文辉王君伟东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

通过对鹅IFN-α成熟蛋白基因的分析,利用在线软件,将序列中稀有密码子改为优势密码子,优化了密码子适应性指数,更多地采用了利于表达的密码子对,优化了表达的起始区域和终止区域mRNA的二级结构及自由能。然后,将人工合成的鹅IFN-α基因... 详细信息

通过对鹅IFN-α成熟蛋白基因的分析,利用在线软件,将序列中稀有密码子改为优势密码子,优化了密码子适应性指数,更多地采用了利于表达的密码子对,优化了表达的起始区域和终止区域mRNA的二级结构及自由能。然后,将人工合成的鹅IFN-α基因与表达载体pWL连接后诱导表达。SDS-PAGE分析表明,所表达蛋白的分子质量为18.83 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的35.3%。表达产物以包涵体形式存在。复性、纯化后的鹅IFN-α重组蛋白的纯度达98%,活性达1.28×107U/mL。

关键词：鹅 α-干扰素基因基因优化纯化生物学活性

东北白鹅CD4基因的克隆及其胞外区的表达与抗血清的制备

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畜牧兽医学报 2014年第4期45卷 639-646页

作者：张雪莲魏双施邵建伟母晓宇高明春张文龙马波王君伟东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

本研究根据GenBank公布的绿头鸭CD4(AF378701)基因序列设计引物,RT-PCR获得东北白鹅CD4基因。根据测序结果设计特异性引物,克隆得到东北白鹅CD4胞外区基因,并在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导重组蛋白获... 详细信息

本研究根据GenBank公布的绿头鸭CD4(AF378701)基因序列设计引物,RT-PCR获得东北白鹅CD4基因。根据测序结果设计特异性引物,克隆得到东北白鹅CD4胞外区基因,并在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导重组蛋白获得表达,Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,以纯化的重组蛋白为免疫原制备兔抗鹅CD4胞外区抗血清。I-ELISA、Western blot和流式细胞仪分析表明抗血清可特异识别重组蛋白以及分离获得的东北白鹅外周血T淋巴细胞,间接免疫荧光试验证实纯化的抗血清可特异性识别瞬时真核表达的鹅CD4胞外区蛋白。以上结果说明制备的抗血清可作为鹅CD4+T淋巴细胞的检测试剂。

关键词：东北白鹅 CD4 基因表达 T淋巴细胞

人源Mur血型抗体的鉴定和应用——附1例报告

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中国输血杂志 2016年第12期29卷 1327-1330页

作者：孙爱农魏双施廖艳婷黄小红易峰何锐洪段生宝丁少华李勇中山市中心血站广东中山528400 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

目的对1名AB型献血者血液中的抗-Mur抗体系统地进行特异性、反应能力等检测,并利用此抗体对中山市人群Mur抗原发生频率进行调查。方法在本实验室,应用合成的Mur抗原特异性多肽,通过红细胞多肽凝集抑制试验鉴定抗-Mur;英国国际血型参比... 详细信息

目的对1名AB型献血者血液中的抗-Mur抗体系统地进行特异性、反应能力等检测,并利用此抗体对中山市人群Mur抗原发生频率进行调查。方法在本实验室,应用合成的Mur抗原特异性多肽,通过红细胞多肽凝集抑制试验鉴定抗-Mur;英国国际血型参比实验室对该抗体进行了经典血型血清学试验、试管凝集方法和Miltenberger抗原谱细胞鉴定抗-Mur。观察蛋白水解酶、酸碱度对Mur抗原抗体反应的影响,以微量板盐水法检测广东中山地区Mur抗原发生频率。结果确定了该抗体是高质量的Mur血型抗原检测试剂;木瓜酶、菠萝酶能破坏Mur抗原,弱酸性环境能增强Mur抗原抗体反应,中山地区献血者Mur抗原占7.31%(128/1 752)。结论我们发现的这例人源抗-Mur,无ABO天然抗体存在,效价高,特异性强,为理想的Mur血型定型抗体,为今后国内外输血界对Mur血型相关研究提供了基本保证。中山地区Mur抗原发生频率较高,输血时应该予以充分的重视。

关键词：血型抗-Mur Mur多肽抗原抗原频率

在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的可溶性犬α7干扰素

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中国预防兽医学报 2013年第4期35卷 321-324页

作者：唐博崔子寅王艺萌魏双施高明春王君伟东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬α干扰素(CaIFN-α),本研究从犬肝脏中PCR获得CaIFN-α第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过重叠延伸PCR方法在CaIFN-α7的N端融合连接内含肽SspDnaB intein(SDI)基因,并将该融合基因连接至p... 详细信息

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬α干扰素(CaIFN-α),本研究从犬肝脏中PCR获得CaIFN-α第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过重叠延伸PCR方法在CaIFN-α7的N端融合连接内含肽SspDnaB intein(SDI)基因,并将该融合基因连接至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的CaIFN-α重组质粒。重组质粒在大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析纯化后可以得到纯度较高的目的蛋白。重组蛋白经MDCK-CDV检测系统证明具有生物学活性,为该干扰素的大量生产及临床应用奠定了基础。

关键词：犬α干扰素内含肽麦芽糖结合蛋白可溶性表达抗病毒活性

CRISPR/Cas系统的核酸诊断技术应用进展

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分子诊断与治疗杂志 2021年第11期13卷 1731-1734,1739页

作者：刘晓玫魏双施于农中国科学院苏州生物医学工程技术研究所中国科学院生物医学检验技术重点实验室江苏苏州215163 苏州高新区人民医院检验科江苏苏州215129

建立快速、灵敏、特异的核酸分析方法,对于精准的疾病诊断和有效的临床治疗具有重要意义。规则成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)系统被认为是具有广泛医学应用潜力的通用型基因组编辑工具。近几年,由于CRISPR/Cas系统高度的灵活性、敏感... 详细信息

建立快速、灵敏、特异的核酸分析方法,对于精准的疾病诊断和有效的临床治疗具有重要意义。规则成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)系统被认为是具有广泛医学应用潜力的通用型基因组编辑工具。近几年,由于CRISPR/Cas系统高度的灵活性、敏感性和特异性而被开发用于病原体检测、肿瘤早期诊断、单核苷酸多态性(SNP)分析等。本文概括介绍了CRISPR/Cas系统核酸检测技术及其应用进展。

关键词： CRISPR/Cas系统核酸检测病原检测肿瘤诊断