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MHC polymorphism and disease resistance to Singapore grouper iridovirus(SGIV) in the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides

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Science Bulletin 2016年第9期61卷 693-699页

作者：杨敏魏京广李鹏飞魏世娜黄友华秦启伟 Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology South China Sea Institute of Oceanology Chinese Academy of Sciences University of Chinese Academy of Sciences

Major histocompatibility complex （MHC） genes are critical members in both innate and adaptive immunity, and the association between their polymorphism and disease resistance has been reported in many teleosts. In the present study, we first investigated the genetic variation at the MHC II β gene in orange-spotted grouper （Epinephelus coioides） after a challenge with Singapore grouper iridovirus （SGIV）. The results reveal that a high polymorphism level of the MHC II β gene （H = 1.000; K = 20.206; π=0.081） and at least three loci exist in grouper. The rate of dN/dS in the peptide-binding region （PBR） and non-PBR were both 〉1, suggesting the loci were evolving under positive selection. A high ratio of heterozygous individuals （37.26 %） and high rate of dN/dS were discovered, suggesting that both heterozygote advantage and frequency-dependent selection might result in the high polymorphism levels in MHC II β genes in grouper. A total of 33 MHC II β alleles were identified from 40 high-susceptibility （HS） and 40 high-re- sistance group （HR） individuals, and 15 alleles were used in the association analysis. Three alleles, EPCO-DBB＊0302, EPCO-DBB＊0307, EPCO-DBB＊0603, and EPCO- DBB＊1001 were significantly associated with resistance ability to SG1V, and the EPCO-DBB＊0607 and EPCO-DBB＊1303 alleles were associated with susceptibility （P 〈 0.05）. To further confirm the association, another independent challenge experiment was performed. The result of association analysis in the verification test found that only EPCO-DBB＊1001 alleles were significantly asso- ciated with resistance to SGIV （P 〈 0.05）, while the other alleles showed no significance （P 〉 0.05） in the frequency distribution between HR and HS groups. Therefore, the EPCO-DBB＊ 1001 alleles could be used as a disease resis- tance-related MHC marker in the molecular marker-assisted selective breeding program of grouper.

关键词： Orange-spotted grouper Majorhistocompatibility complex II β Singapore grouperiridovirus Disease resistance

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红笛鲷NCCRP-1基因的克隆和表达分析

红笛鲷NCCRP-1基因的克隆和表达分析

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作者：魏世娜广东海洋大学

学位级别：硕士

鱼类的非特异性细胞毒性细胞(NCC)在进化上是自然杀伤细胞(NK)的前体细胞,与NK细胞的功能等同,而且这种免疫细胞从鱼类到哺乳动物的进化是保守的。NCC主要来源于血液和淋巴器官,是鱼类防御病毒、细菌、寄生性原生动物等入侵的第一道防线... 详细信息

鱼类的非特异性细胞毒性细胞(NCC)在进化上是自然杀伤细胞(NK)的前体细胞,与NK细胞的功能等同,而且这种免疫细胞从鱼类到哺乳动物的进化是保守的。NCC主要来源于血液和淋巴器官,是鱼类防御病毒、细菌、寄生性原生动物等入侵的第一道防线,在鱼类非特异性免疫中起重要作用。目前的研究表明NCCRP-1受体蛋白位于NCC膜上,在鱼类炎症反应中可能通过颗粒胞吐途径参与抗菌的先天性免疫。NCCRP-1是NCC发挥功能的分子基础,在识别靶细胞和细胞毒性激活方面起着重要的作用。本论文以我国南方主要海水养殖鱼类之——红笛鲷(Lutjanus sanguineus)为研究对象,对红笛鲷NCCRP-1基因进行克隆和表达。用生物信息学方法对鱼类已知的NCCRP-1基因进行序列比对,根据序列保守区域设计并合成简并引物。从红笛鲷头肾组织中提取总RNA,应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,获得NCCRP-1基因全长cDNA序列。NCCRP-1基因全长为980 bp,完整开放阅读框(ORF)为702 bp,编码233个氨基酸,5′非编码区为42 bp,3′非编码区为236 bp。红笛鲷NCCRP-1与金头鲷NCCRP-1的同源率最高,为84%,而与哺乳动物NCCRP-1的同源率相对较低。将NCCRP-1基因与原核表达载体pET-21a进行连接,构建重组表达载体,然后转入*** BL21内进行诱导表达。在IPTG的浓度为0.8 mmol/L、37℃培养3 h条件下,目的基因表达效果最佳。本研究成功获得了高表达的重组目的蛋白,分子量与预期值相符,融合蛋白主要以包涵体形式存在,通过HisTrap HP柱子纯化融合蛋白。Western blot分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合,确切表明所表达出的蛋白为目的蛋白。应用Real-time PCR技术,以β-actin和GAPDH基因为内参,研究了NCCRP-1基因在感染溶藻弧菌后红笛鲷头肾、胸腺、肝脏、脾脏、心脏、鳃、肌肉和肠8个组织中的表达特性,分析了不同温度、盐度刺激4h后头肾组织中NCCRP-1基因的表达差异,实验结果表明,红笛鲷经溶藻弧菌感染4h后NCCRP-1基因在8个组织内均有表达,但在头肾中表达量最大,其次是在脾脏、肝脏,再次是在肌肉、鳃、胸腺和心脏,在肠中表达量最低;在温度22℃、盐度20的条件下,头肾组织中NCCRP-1基因的表达量较大。本论文的研究为红笛鲷疾病防治提供了一定的理论依据,丰富和发展了鱼类分子免疫学的研究内容,为进一步研究NCCRP-1蛋白的生物学特性以及在鱼类先天性免疫中的功能研究奠定基础。

关键词：红笛鲷 NCCRP-1 RACE 原核表达荧光定量PCR

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石斑鱼两种溶菌酶基因的分子克隆与功能研究

石斑鱼两种溶菌酶基因的分子克隆与功能研究

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“全球变化下的海洋与湖沼生态安全”学术交流会

作者：魏世娜秦启伟中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室中国科学院南海海洋研究所中国科学院大学

石斑鱼是我国南方沿海地区重要的海水养殖经济鱼类,但病害频发给养殖业造成巨大的经济损失。因此,研究石斑鱼自身免疫相关基因及其机制,提高其免疫力和抗病力,对石斑鱼的健康养殖十分重要。溶菌酶是一种能水解肽聚糖的碱性酶,它能催化... 详细信息

石斑鱼是我国南方沿海地区重要的海水养殖经济鱼类,但病害频发给养殖业造成巨大的经济损失。因此,研究石斑鱼自身免疫相关基因及其机制,提高其免疫力和抗病力,对石斑鱼的健康养殖十分重要。溶菌酶是一种能水解肽聚糖的碱性酶,它能催化细菌细胞壁中肽聚糖N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键的水解,破坏肽聚糖支架,在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,引起细菌裂解;在机体先天免疫系统中参与多种免疫反应,并协同其他免疫因子共同防御外来病原的入侵。溶菌酶还能与带负电荷的病毒蛋白直接作用,与DNA、RNA和脱辅基蛋白形成复合物使病毒失活。本研究从石斑鱼脾组织中克隆获得两种类型的溶菌酶:C型（Ec-lysC）和G型（Ec-lysG）溶菌酶。经LPS、溶藻弧菌和石斑鱼虹彩病毒SGIV刺激石斑鱼后,对Ec-lysC和Ec-lysG在头肾中的表达量进行荧光定量PCR分析,结果显示表达量均具有不同程度的升高,说明其在细菌和病毒的感染中发挥了相对重要的作用。将重组蛋白C型溶菌酶（rEc-lysC）和G型溶菌酶（rEc-lysG）纯化后,检测其抗菌活性。结果表明,两种溶菌酶对溶壁微球菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌和海豚链球菌都有一定的抑制性,但作用效果有差异。扫描电镜结果显示,与对照组相比,rEc-lysC对溶壁微球菌的表面形态破坏作用强于rEc-lysG。为进一步研究两种类型溶菌酶在SGIV感染中的作用,筛选了过表达的稳定细胞系,检测Ec-lysC和Ec-lysG过表达情况下SGIV的感染情况。结果揭示,两种类型溶菌酶过表达均能抑制SGIV感染的细胞病变进程,降低了病毒主要衣壳蛋白MCP的表达,但C型溶菌酶的抗病毒效果较明显。以上研究结果表明石斑鱼溶菌酶在宿主抵御细菌和病毒感染的免疫反应中发挥了重要的作用,这不仅丰富了石斑鱼先天性免疫的内容,也为进一步探索石斑鱼免疫机制及疾病防治提供新的策略和理论依据。

关键词：石斑鱼虹彩病毒SGIV 溶菌酶分子特性

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鱼类非特异性细胞毒性细胞(NCC)的研究进展

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中国水产科学 2010年第2期17卷 374-380页

作者：魏世娜简纪常吴灶和鲁义善闫秀英广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室

自然杀伤细胞(NK)进化上的前体细胞在鱼类中被称作非特异性细胞毒性细胞(NCC),主要来源于血液和淋巴器官,是防御细菌、病毒、寄生性原生动物等入侵的第一道防线,在非特异性免疫中起重要作用,还具有体外杀伤肿瘤细胞的功能。近年来免疫... 详细信息

自然杀伤细胞(NK)进化上的前体细胞在鱼类中被称作非特异性细胞毒性细胞(NCC),主要来源于血液和淋巴器官,是防御细菌、病毒、寄生性原生动物等入侵的第一道防线,在非特异性免疫中起重要作用,还具有体外杀伤肿瘤细胞的功能。近年来免疫荧光显微镜技术表明NCAMP-1和NCCRP-1两种受体蛋白均表达于NCC膜上,并且这种免疫细胞从鱼类到哺乳动物上的进化是保守的,这些膜蛋白在鱼类炎症反应期可能通过颗粒胞吐途径参与抗菌的先天性免疫。本文就NCC的分离鉴定、形态结构、功能受体作用机制等方面的研究成果作一综述,旨在为深入研究NCC在鱼类先天性防御中的作用提供依据。

关键词：非特异性细胞毒性细胞分离鉴定 NCC受体

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利用人文知识丰富《水产品加工技术》课程趣味性的教学改革探索

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学周刊 2022年第21期21卷 3-5页

作者：杨敏王劭雯魏世娜华南农业大学海洋学院广东广州510642

近年来,随着互联网的普及,人们对知识的学习范围也在逐步扩大,不会仅限于从事的相关专业,尤其是人文知识,人们对于人文知识的了解也越来越多,对提高教学质量和教学效果有重要帮助。在给水产养殖学专业学生进行《水产品加工技术》专业拓... 详细信息

近年来,随着互联网的普及,人们对知识的学习范围也在逐步扩大,不会仅限于从事的相关专业,尤其是人文知识,人们对于人文知识的了解也越来越多,对提高教学质量和教学效果有重要帮助。在给水产养殖学专业学生进行《水产品加工技术》专业拓展课程的授课过程中,引入相关人文政治、人文地理和人文历史知识,可以吸引学生注意力,提高学生兴趣,增加课程的丰富性和广泛性。通过对我国发展海洋经济的战略思想的学习,让学生从大局上理解学习该门课程的目的和意义;通过对各水产品出产地风土人情及饮食文化相关知识的学习,让学生对水产品加工有更加全面的了解;通过对各种加工工艺背后的历史文化故事的讲述,使学生对课程有更加立体、生动形象的认识。

关键词：水产品加工技术人文知识教学改革应用实例

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鱼类溶菌酶和组织蛋白酶研究进展

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广西科学 2018年第1期25卷 32-35页

作者：魏世娜秦启伟华南农业大学海洋学院，广东广州 510642

溶菌酶和组织蛋白酶在鱼类先天性免疫系统中发挥重要作用。溶菌酶是一种具有生物活性的、能水解粘多糖的无毒、无公害小分子碱性酶,参与机体多种免疫反应,在抵抗外来病原细菌、真菌、病毒或肿瘤入侵中起重要作用。组织蛋白酶是半胱氨酸... 详细信息

溶菌酶和组织蛋白酶在鱼类先天性免疫系统中发挥重要作用。溶菌酶是一种具有生物活性的、能水解粘多糖的无毒、无公害小分子碱性酶,参与机体多种免疫反应,在抵抗外来病原细菌、真菌、病毒或肿瘤入侵中起重要作用。组织蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族的主要成员,参与机体的多种生理和病理活动,目前在细胞凋亡中的作用日益受到重视。本综述主要介绍近年来鱼类溶菌酶和组织蛋白酶在生物学功能、基因克隆、组织分布及重组蛋白功能活性的新研究进展。

关键词：鱼类溶菌酶组织蛋白酶生物学特性基因与蛋白

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MATLAB在基于创新素质培养的生物统计学教学中的应用探讨

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科教导刊（电子版） 2023年第28期 68-70,74页

作者：王劭雯李强杨敏魏世娜秦启伟华南农业大学海洋学院广东广州 510642 广东海洋大学海洋与气象学院广东湛江 524088

针对生物统计学知识抽象、不易理解等特点,使用MATLAB软件作为辅助平台,提供生动形象的案例,将公式蕴含的内容可视化呈现,有助于学生更好地理解和掌握.文章以生物统计学的中心极限定理为例,通过MATLAB模拟了"独立同分布的中心极限定理"... 详细信息

针对生物统计学知识抽象、不易理解等特点,使用MATLAB软件作为辅助平台,提供生动形象的案例,将公式蕴含的内容可视化呈现,有助于学生更好地理解和掌握.文章以生物统计学的中心极限定理为例,通过MATLAB模拟了"独立同分布的中心极限定理",使学生直观看懂定理的含义.因此,将MATLAB融入生物统计学的教学实践过程中,既实现了教学与科研相结合的目标,同时加强了本科生对科学前沿和国家需求的认识.

关键词：生物统计学 MATLAB 案例模拟教学实践

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特异性识别石斑鱼虹彩病毒SGIV感染的核酸适配体筛选与应用

特异性识别石斑鱼虹彩病毒SGIV感染的核酸适配体筛选与应用

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2016年中国水产学会学术年会

作者：李鹏飞周伶俐魏世娜秦启伟广西科学院广西近海海洋环境科学重点实验室中国科学院南海海洋研究所华南农业大学海洋学院

近年来爆发和流行的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）严重制约着石斑鱼养殖业的可持续健康发展。指数富集的配基系统进化技术（SELEX）是一类新型的生物文库技术。由SELEX技术筛选得到的核酸适配体具有与单克隆抗体相当的高特异性和高亲和性,并... 详细信息

近年来爆发和流行的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）严重制约着石斑鱼养殖业的可持续健康发展。指数富集的配基系统进化技术（SELEX）是一类新型的生物文库技术。由SELEX技术筛选得到的核酸适配体具有与单克隆抗体相当的高特异性和高亲和性,并且具有诸多优点,如没有免疫原性,温度变化引起的变性是可逆的,筛选时间短费用低,易于合成和后期修饰,目前已发展成为一种备受关注的新型检测和治疗工具。本研究以SGIV感染的细胞为筛选靶标,筛选获得的核酸适配体不但能够特异性识别SGIV感染,而且具有抑制病毒感染的能力;适配体还能够通过主动运输特异性地结合内吞进入病毒感染的细胞,因此可以将其作为药物运输载体,研发出低毒、高特异性的靶向治疗药物;基于筛选获得的适配体,首次研发出操作简便,可以快速准确检测SGIV感染的Apt-ELASA技术,为丰富和提高各领域的检测技术提供了新方法和新思路。

关键词：核酸适配体水产养殖 SGIV 抗病毒快速检测

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石斑鱼c-Jun基因在虹彩病毒SGIV感染中的功能分析

石斑鱼c-Jun基因在虹彩病毒SGIV感染中的功能分析

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2016年中国水产学会学术年会

作者：魏世娜黄晓红黄友华秦启伟中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室中国科学院南海海洋研究所

c-jun蛋白在炎症反应和病毒感染中起了重要的作用。本研究通过RACE扩增得到石斑鱼c-Jun基因的cDNA全长。c-Jun基因在石斑鱼正常组织心脏、肾脏、头肾、脾脏、鳃、肠中表达相对较高,而在脑、皮肤、胃、肝、肌肉中相对较低。SGIV刺激细胞... 详细信息

c-jun蛋白在炎症反应和病毒感染中起了重要的作用。本研究通过RACE扩增得到石斑鱼c-Jun基因的cDNA全长。c-Jun基因在石斑鱼正常组织心脏、肾脏、头肾、脾脏、鳃、肠中表达相对较高,而在脑、皮肤、胃、肝、肌肉中相对较低。SGIV刺激细胞后,头肾组织中c-Jun基因表达量明显增加,推测c-Jun在SGIV感染中发挥了一定的作用。亚细胞定位结果表明,野生型Wt-c-Jun和显性负性突变体Dominant-negative（Dn-c-Jun）基因均主要分布于细胞核中,揭示该基因的磷酸化位点对于该基因亚细胞定位没有明显的影响。当在转染的细胞中感染SGIV后,大部分野生型Wt-c-Jun的绿色荧光从细胞核中转移到胞质中的病毒装配中心,这和我们以前报道的研究结果是一致的。而Dn-c-Jun的绿色荧光的定位没有发生明显的变化,仍然主要分布在细胞核,推测该基因的磷酸化位点对于该基因的功能是必需的（图）。与空载体对照组相比,过表达Dn-c-Jun基因不仅能明显延缓SGIV感染引起的细胞病理变化和降低病毒基因的转录,还能抑制c-Jun和AP1基因的启动子活性,推测野生型的Ec-Jun基因磷酸化有利于SGIV的复制。

关键词：石斑鱼 c-Jun基因虹彩病毒SGIV 功能分析

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石斑鱼GB型溶菌酶基因的克隆及功能分析

石斑鱼GB型溶菌酶基因的克隆及功能分析

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热带海洋科学学术研讨会暨第八届广东海洋湖沼学会、第七届广东海洋学会会员代表大会

作者：魏世娜黄友华蔡佳黄晓红秦启伟中国科学院南海海洋研究所

石斑鱼是我国南方重要的海水养殖品种之一,但随看近年来集约化高密度养殖以及养殖规模的不断扩大,导致鱼类疾病频繁爆发,使海水养殖业遭受巨大损失。其中弧菌病和病毒性疾病如石斑鱼虹彩病毒即是重要的病原。新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV... 详细信息

石斑鱼是我国南方重要的海水养殖品种之一,但随看近年来集约化高密度养殖以及养殖规模的不断扩大,导致鱼类疾病频繁爆发,使海水养殖业遭受巨大损失。其中弧菌病和病毒性疾病如石斑鱼虹彩病毒即是重要的病原。新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是一种新型的致病水产病毒,其感染机制的相关研究还相对较少。因此,为阐明石斑鱼的抗菌抗病毒先天性免疫防御机制,本文通过克隆溶菌酶基因,分析其结构与功能,为石斑鱼疾病防治研究提供新的思路。溶菌酶是生物体内重要的非特异性免疫因子之一,在抵抗外来病原入侵中起重要作用。溶菌酶能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键之间的联结,破坏肽聚糖支架,在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,引起细菌裂解;还能与带负电荷的病毒蛋白直接作用,与DNA、RNA和脱辅基蛋白形成复合物使病毒失活。本研究运用RACE技术,从石斑鱼脾脏cDNA中克隆得到GB型溶菌酶基因,其cDNA全长1419bp,编码256个氨基酸;基因组全长为2062bp,包含4个外显子和3个内含子。氨基酸比对发现具有保守的催化位点和半胱氨酸残基;进化分析表明其与鳜鱼相似度最高:real-timePCR结果显示,GB型溶菌酶在各个组织中均有分布,分别为肝脏、脾脏、肾脏、头肾、鳃、脑、肠、皮肤、胃、心脏、肌肉,而在头肾、肠和鳃中的表达量相对较高;经LPS、SGIV、Vibrio alginolyticus刺激后,在头肾中的表达量均有不同程度的上调;业细胞定位分析显示GB型溶菌酶主要分布在细胞质中:在pH值6.0,温度35℃条件下,原核表达的重组蛋白GB型溶菌酶活性最高,其具有抗革兰氏阳性菌溶壁微球菌、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌溶藻弧菌的活性。利用体外过量表达系统,结果揭示GB型溶菌酶过量表达能够抑制SGIV的感染,体现在能够推迟SGIV感染引起CPE的出现,抑制病毒感染过程中MCP基因的转录,以上结果说明GB型溶菌酶可能在石斑鱼的抗菌抗病毒先天性免疫中起重要的作用。

关键词：石斑鱼 GB型溶菌酶抗菌抗病

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