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针对EGFP的siRNA表达载体的构建、鉴定及哺乳动物细胞中NS5B的表达对RNAi效应的影响

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针对EGFP的siRNA表达载体的构建、鉴定及哺乳动物细胞中NS5B的表...

作者：马龙洋第四军医大学

学位级别：硕士

RNA干涉(RNA imerference,RNAi),是双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默效应,它通过双链RNA介导的靶序列特异性的降解从而抑制相应基因的表达。自1998年发现以来,特别是siRNA表达载体设计成功之后,RNAi作为一种高效特异的抑制基因... 详细信息

RNA干涉(RNA imerference,RNAi),是双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默效应,它通过双链RNA介导的靶序列特异性的降解从而抑制相应基因的表达。自1998年发现以来,特别是siRNA表达载体设计成功之后,RNAi作为一种高效特异的抑制基因表达的新技术,已被广泛应用于功能基因组学和基因治疗等多种研究中。在哺乳动物细胞中,是否也存在着沉默信号的放大作用,目前仍不甚清楚。 pSUPER siRNA表达载体是由RNA Polymerase Ⅲ类的H1启动子转录产生缺乏PolyA的小RNA,它有精确的转录起始位点和五个连续的胸腺嘧啶核苷酸(TTTTT)作为转录终止信号。以DNA为模板转录出的RNA先自身折叠形成小发夹状,在细胞内经加工后与化学合成的siRNA结构类似,能够发挥其抑制靶基因表达的作用。报告基因增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescence Protein,

关键词： RNA干扰增强型绿色荧光蛋白 RNA依赖的RNA聚合酶

淇河鲫抗菌肽hepcidin基因的克隆及其表达分析

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淇河鲫抗菌肽hepcidin基因的克隆及其表达分析

作者：马龙洋河南师范大学

学位级别：硕士

抗菌肽是由生物细胞特定基因编码,经过外界条件诱导产生的一类具有广谱杀菌活性作用的多肽。近年来发现的新型抗菌肽hepcidin,在鱼类中广泛存在,主要是由生物体肝脏特异性表达的一种阳离子小分子多肽。可以抑制多种病毒、细菌、真菌和... 详细信息

抗菌肽是由生物细胞特定基因编码,经过外界条件诱导产生的一类具有广谱杀菌活性作用的多肽。近年来发现的新型抗菌肽hepcidin,在鱼类中广泛存在,主要是由生物体肝脏特异性表达的一种阳离子小分子多肽。可以抑制多种病毒、细菌、真菌和原生动物的生长繁殖,在鱼类非特异性免疫中起重要作用,同时也可以作为一种信号分子,参与机体铁代谢。本研究根据Gen Bank登录的已知鱼类抗菌肽hepcidin基因的保守区设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE的方法获得淇河鲫(Qihe crucian carp Carassius auratus)hepcidin基因全长c DNA序列,并对基因序列及其编码的多肽进行了结构和系统进化分析。得到淇河鲫hepcidin c DNA全长708 bp,包含开放阅读框(ORF)258bp,5′非翻译区(5′-UTR)94 bp和3′非翻译区(3′-UTR)356 bp,其中3′-UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和2个m RNA不稳定基序(ATTTA)。开放阅读框编码一个85个氨基酸的成熟肽前体,由信号肽(24个氨基酸残基)、前体肽(36个氨基酸残基)和成熟肽(25个氨基酸残基)3部分序列组成。成熟肽含有8个保守的半胱氨酸残基,通过4个链内二硫键形成单一发卡结构,拐角处有一个特殊的二硫键,可能与hepcidin的抗菌活性直接相关。序列分析表明,与已报道的其他鱼类hepcidin相比较,核苷酸序列具有很高的序列相似性,翻译的成熟肽与其他种类生物的成熟肽进行系统进化分析,结果显示与报道的其他鱼类hepcidin具有较高的同源性,且与鲤鱼的亲缘关系最近,而与哺乳类和两栖类在不同的分支上。采用RT-q PCR的方法检测淇河鲫不同组织hepcidin m RNA表达水平,以及腹腔注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和脂多糖(LPS)后各组织的表达变化,结果显示在正常淇河鲫中,肝脏中hepcidin m RNA表达水平最高,其次为脾脏和头肾,在鳃和肾中的水平较低,而在心脏、肠、肌肉、脑和血液中m RNA的表达量则更少。淇河鲫经过嗜水气单胞菌注射和LPS刺激后,选取hepcidin m RNA表达量较高的五种组织(鳃,肾脏、脾脏、肝脏、头肾)检测表达的时序变化。结果显示整体水平呈先升高再下降的趋势,但不同组织的表达模式也有不同。注射LPS的鱼体中,头肾、肾脏和脾脏hepcidin m RNA水平在刺激后6 h达到最大值,可达到对照组水平的100多倍;鳃中hepcidin m RNA水平在刺激后12 h达到最大值,约为对照组水平的60倍;肝脏hepcidin m RNA水平在刺激后3 h开始上升,到24 h才达到最高,约为对照组的30倍,之后慢慢回落。注射嗜水气单胞菌的鱼体中,脾脏在6 h达到最高,hepcidin m RNA水平约为对照组的150倍;鳃、肾脏、头肾在12 h达到最高,鳃和肾hepcidin m RNA水平约为对照组的80倍,头肾为150倍;肝脏在24 h达到最高,约为对照组hepcidin m RNA水平的18倍。腹腔注射生理盐水对照组鱼的hepcidin m RNA水平显示变化幅度不大。构建原核表达载体p ET32a(+)epcidin,转化入大肠杆菌BL-21中经IPTG诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测。结果显示在细菌裂解液的上清和包涵体沉淀中均存在一条分子量21 k D的特异性条带,与hepcidin融合蛋白预期的分子量(21.72k D)大小基本一致。且在IPTG诱导8 h左右时表达量最高,对后续的蛋白纯化及抗菌活性检测实验提供了参考依据。

关键词：淇河鲫抗菌肽 hepcidin 基因克隆细菌感染嗜水气单胞菌基因表达

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创伤复苏单元的特征及建设要点

中华创伤杂志 2021年第12期37卷 1057-1061页

作者：党星波杜工亮马龙洋陕西省人民医院急诊外科西安710068

严重创伤多为高能量损伤,多发伤发生率高。院内早期合理的评估和复苏是救治成功的关键。创伤复苏单元(TRB)是院内早期评估和复苏严重创伤的主要区域,能够最大限度保障快速抢救。目前,对于严重创伤,院内早期救治大多集中在急诊抢救室进行... 详细信息

严重创伤多为高能量损伤,多发伤发生率高。院内早期合理的评估和复苏是救治成功的关键。创伤复苏单元(TRB)是院内早期评估和复苏严重创伤的主要区域,能够最大限度保障快速抢救。目前,对于严重创伤,院内早期救治大多集中在急诊抢救室进行,但存在很多弊端,如空间有限创伤救治团队难以有效施救、床旁影像学检查难以展开、救命性操作难以顺利进行、影响内科急症患者的救治等,均导致创伤早期救治质量下降。随着创伤中心建设的深入和拓展,专门用于严重创伤早期评估和复苏处置的TRB应运而生。笔者根据我国创伤救治体系的特点,对TRB的特征和优势、功能和运行要求,不同级别创伤中心TRB组成要素及中国TRB建设现状进行探讨,为各级创伤中心建设TRB提供借鉴。

关键词：多处创伤复苏术创伤诊治中心创伤复苏单元

水生动物组蛋白衍生抗菌肽的结构特征和抗菌活性研究进展

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河南农业科学 2015年第4期44卷 9-13页

作者：费威李慧马龙洋裴超孔祥会河南师范大学水产学院河南新乡453007

新型抗菌肽取代传统抗生素是未来水产养殖业的发展趋势,组蛋白衍生抗菌肽是水生动物体内的一类重要抗菌肽,在水生动物机体免疫和抗病过程中扮演重要角色,为当前的研究热点。分别对水生动物4种代表性的组蛋白衍生抗菌肽(OncorhyncinⅡ、B... 详细信息

新型抗菌肽取代传统抗生素是未来水产养殖业的发展趋势,组蛋白衍生抗菌肽是水生动物体内的一类重要抗菌肽,在水生动物机体免疫和抗病过程中扮演重要角色,为当前的研究热点。分别对水生动物4种代表性的组蛋白衍生抗菌肽(OncorhyncinⅡ、Buforins、Abhisin和HLP-1)的结构特征和抗菌效应进行综述,旨在为组蛋白衍生抗菌肽的深入研究和推广应用提供参考。

关键词：组蛋白衍生抗菌肽结构特征抗菌效应水生动物

交锁髓内钉动力化治疗股骨干骨折延迟愈合的临床研究

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实用临床医药杂志 2017年第15期21卷 151-152页

作者：刘建敏马龙洋党星波陕西省人民医院急诊外科陕西西安710068

交锁髓内钉（IIN）技术已逐渐成为近年来临床治疗长骨骨折的金标准。随着髓内钉的广泛应用,由于静力钉对骨折端轴向负荷的影响,导致骨折延迟愈合或者不愈合也日渐增多。骨折延迟愈合是指经正常骨折愈合恢复期之后,骨折患者骨端未出现明... 详细信息

交锁髓内钉（IIN）技术已逐渐成为近年来临床治疗长骨骨折的金标准。随着髓内钉的广泛应用,由于静力钉对骨折端轴向负荷的影响,导致骨折延迟愈合或者不愈合也日渐增多。骨折延迟愈合是指经正常骨折愈合恢复期之后,骨折患者骨端未出现明显的硬化以及髓腔闭塞现象,也未见明显吸收以及间隙,骨端周围未有连续性骨痂生长。

关键词：股骨干骨折交锁髓内钉延迟愈合

人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体的构建和表达

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第5期24卷 493-494页

作者：李丙所马龙洋周红兵党军强任彦顺窦科峰第四军医大学西京医院肝胆外科陕西西安710032

目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSectag2/scFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达。方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体pSectag2,构建重组载... 详细信息

目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSectag2/scFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达。方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体pSectag2,构建重组载体pSectag2/scFv,测序鉴定后,电转染CHO细胞,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达情况。结果:将750bp人源肝癌scFv插入真核表达载体pSectag2,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag2/scFv。将pSectag2/scFv转染CHO细胞后获得目的蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot检测表明目的蛋白Mr约为34000。结论:成功地构建抗scFv真核表达载体pSectag2/scFv,并在CHO细胞中获得表达,为人源肝癌scFv的进一步的应用研究提供依据。

关键词：肝癌单链抗体 CHO细胞基因表达

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陕西省创伤救治体系及创伤中心建设构想

中华创伤杂志 2019年第8期35卷 677-681页

作者：杜工亮马龙洋党星波李军胡炜刘建敏杨德庆陕西省人民医院急诊外科西安710068

由于中国尚未建立完善的区域性创伤救治体系及规范的各级创伤中心,导致创伤救治水平低于发达国家.陕西省目前也未建立区域性创伤救治体系及规范的各级创伤中心.笔者分析陕西省地理、人口、社会环境等特点,以陕西省人民医院创伤中心(Ⅰ... 详细信息

由于中国尚未建立完善的区域性创伤救治体系及规范的各级创伤中心,导致创伤救治水平低于发达国家.陕西省目前也未建立区域性创伤救治体系及规范的各级创伤中心.笔者分析陕西省地理、人口、社会环境等特点,以陕西省人民医院创伤中心(Ⅰ级创伤中心)为平台,探讨陕西省创伤救治体系及各级创伤中心建设的构想,明确各级创伤救治中心各自的硬件设施、团队结构、救治流程、质控目标,确定各级创伤中心专业化创伤团队的培训、管理制度,为提高陕西省创伤救治的整体水平提供借鉴.

关键词：创伤和损伤创伤诊治中心创伤救治体系

全人源性肝癌单链抗体的表达、纯化及功能鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第7期23卷 649-651,656页

作者：赵清涛马龙洋薛国柱赵爱志窦科峰第四军医大学西京医院肝胆外科陕西西安710032

目的:在大肠杆菌中表达人源性肝癌单链抗体(scFv),并分析他的结合活性。方法:应用噬菌体表面呈现技术获得人源性肝癌scFv,利用重叠延伸PCR将VL和VH基因以(Gly4ser)3linker连接成单链,插入表达载体pET28a(+),诱导目的蛋白表达,对包涵体... 详细信息

目的:在大肠杆菌中表达人源性肝癌单链抗体(scFv),并分析他的结合活性。方法:应用噬菌体表面呈现技术获得人源性肝癌scFv,利用重叠延伸PCR将VL和VH基因以(Gly4ser)3linker连接成单链,插入表达载体pET28a(+),诱导目的蛋白表达,对包涵体进行溶解、复性、纯化,得到可溶性目的蛋白,应用非竞争细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及结合能力。结果:在A600为0.8时开始诱导,持续6h,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的26%,包涵体经过复性纯化后,得到纯度达到95%的重组scFv,其亲和常数为:3.6×107mol/L。结论:实现了人源性肝癌scFv的蛋白表达,抗体蛋白与肝癌细胞具有较强的特异性结合能力,为今后进行免疫学检测和开发肿瘤靶向治疗提供了研究手段。

关键词：肝癌单链抗体表达生物活性

靶向hTERT RNA干涉促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第4期21卷 524-526页

作者：赵英任君琳张瑞马龙洋鲍炜王成济杨安钢第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032 第四军医大学基础部免疫学教研室陕西西安710032 第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室陕西西安710032第四军医大学基础部免疫学教研室陕西西安710032

目的:利用RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达,探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。方法:将成功构建的针对hTERT的siRNA(smallinterferencingRNA)表达载体转染HeLa细胞,通过透射电镜、免疫印迹和流式细胞术(FCM)等方法检测人宫颈癌HeLa细... 详细信息

目的:利用RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达,探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。方法:将成功构建的针对hTERT的siRNA(smallinterferencingRNA)表达载体转染HeLa细胞,通过透射电镜、免疫印迹和流式细胞术(FCM)等方法检测人宫颈癌HeLa细胞的凋亡情况。结果:构建的siRNA表达载体可以诱导HeLa细胞发生凋亡。结论:针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体稳定转染HeLa细胞,可诱导HeLa细胞发生凋亡。

关键词： RNA干涉人端粒酶逆转录酶凋亡 HeLa细胞