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基于RNA-Seq的雅致放射毛霉AS3.2778氨肽酶研究

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基于RNA-Seq的雅致放射毛霉AS3.2778氨肽酶研究

作者：马纳纳华南理工大学

学位级别：硕士

雅致放射毛霉(Actinomucor elegans),在我国是传统食品腐乳酿造加工中常见的优质菌种之一。该丝状真菌可分泌多种蛋白酶系,能较好地水解大豆蛋白等植物蛋白,对腐乳后期发酵过程中风味物质的形成起重要作用。由于该毛霉遗传背景不清晰,... 详细信息

雅致放射毛霉(Actinomucor elegans),在我国是传统食品腐乳酿造加工中常见的优质菌种之一。该丝状真菌可分泌多种蛋白酶系,能较好地水解大豆蛋白等植物蛋白,对腐乳后期发酵过程中风味物质的形成起重要作用。由于该毛霉遗传背景不清晰,其蛋白酶系组成及相关基因都未有报道,限制了其蛋白酶分子水平的研究。本论文首次对麸皮固体培养基上培养48h的Actinomucor elegans AS3.2778进行基于RNA-Seq的转录组测序,得到其蛋白酶酶系的转录表达情况。对转录组数据分析发现,该菌转录组中共有蛋白酶基因106个,其中氨肽酶基因21个。论文进一步重点分析了该菌氨肽酶序列特征、家族分类以及进化关系,并通过实时荧光定量PCR实验和酶活测定实验分析比较了四个时间点氨肽酶的表达量和酶活差异情况,更好解释毛霉在不同生长时期需要产生相应的氨肽酶来满足自身的生长及生理需求。转录组数据显示,毛霉产生的氨肽酶共21种,分属于M1,M17,M24,S9等七个蛋白酶家族,其中大多数氨肽酶是金属蛋白酶。邻接法构建的系统进化树表明同一家族的蛋白酶往往聚在一个进化树枝上。毛霉形态学观察显示,其生长至第2天时菌丝体洁白且浓密,达到旺盛时期;电子显微镜观察结果表明毛霉从第2天开始产生孢子,且孢子数随着培养时间延长而增多。对第1d,2d,3d和4d四个时期的毛霉cDNA进行实时荧光定量PCR验证,发现5号基因(Genbank登录号为KP973585)在第3天的表达量是21种氨肽酶基因中最高的,且大部分基因在第3-4天的表达量达到最大值。第1d,2d,3d和4d的粗酶液酶活测定结果表明:在pH6.5和pH8.0条件下,毛霉粗酶液对所选的十种底物水解程度明显高于pH5.0和pH9.5条件下的水解程度。其中pH6.5时对底物Phe-pNA水解度最高,说明Phe-pNA是毛霉氨肽酶的最适底物,pH6.5是毛霉氨肽酶的最佳pH,且不同时间点的氨肽酶在不同pH条件下对同一底物的酶活也是有差异的。综合以上研究结果表明:雅致放射毛霉具有丰富的蛋白酶系,该菌在第2-3天长势旺盛,氨肽酶表达活跃,酶活相对较高,相关研究为进一步了解该菌的蛋白酶基因及其分子克隆等研究奠定了基础。

关键词：转录组测序雅致放射毛霉氨肽酶实时荧光定量PCR 酶活测定

白木香聚酮环化酶基因AsPKC1的克隆及表达分析

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分子植物育种 2020年第5期18卷 1472-1479页

作者：马纳纳丁旭坡蔡彩虹戴好富梅文莉海南大学园艺学院海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南省黎药天然产物研究与利用重点实验室海口571101

聚酮环化酶是植物聚酮合成途径中的关键酶之一,可催化CoA类前体直接合成多环结构。作为聚酮合成下游产物的2-(2-苯乙基)色酮是名贵中药材沉香形成的重要标志物之一,聚酮环化酶可能在其形成过程中发挥着重要作用。本研究基于白木香结香... 详细信息

聚酮环化酶是植物聚酮合成途径中的关键酶之一,可催化CoA类前体直接合成多环结构。作为聚酮合成下游产物的2-(2-苯乙基)色酮是名贵中药材沉香形成的重要标志物之一,聚酮环化酶可能在其形成过程中发挥着重要作用。本研究基于白木香结香转录组数据,首次克隆了1个白木香聚酮环化酶基因,命名为AsPKC1,该基因的编码区共含1 116个核苷酸,编码371个氨基酸残基。AsPKC1编码的蛋白序列与已报道的PKC蛋白高度相似,与锦葵科棉花、榴莲和可可树具有较近的亲缘关系,聚于进化树的同一分支;该蛋白的等电点为9.04,分子量为40.43 kD,包含3个糖基化位点和28个磷酸化位点,为非分泌型蛋白,α螺旋和无规则卷曲组成其主要二级结构。实时荧光定量PCR验证实验表明AsPKC1的表达具有组织特异性,并且在结香茎干中持续上调表达,其第9天在白木香茎干中的表达量为对照组的6.52倍。本研究为进一步解析聚酮环化酶基因在沉香标志物2-(2-苯乙基)色酮合成及白木香结香过程中的作用提供了数据支持。

关键词：白木香(Aquliaria sinensis) 聚酮环化酶鉴定生物信息学表达

Ca^(2+)对拟南芥侧根生长发育影响的递进因子分析

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2010年第2期38卷 147-152,157页

作者：周索赵丽英杜瑞卿马纳纳雷莹王永勤南阳师范学院生命科学与技术学院河南南阳473061 北京农业生物技术研究中心北京100097

【目的】确定Ca2+在异三聚体G蛋白调控的拟南芥侧根生长发育过程中的作用及可能的信号传递途径。【方法】以拟南芥的野生型(ws)、异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体(gpa1-1,gpa1-2)和超表达突变体(wGα,cGα)为材料,在含有不同质... 详细信息

【目的】确定Ca2+在异三聚体G蛋白调控的拟南芥侧根生长发育过程中的作用及可能的信号传递途径。【方法】以拟南芥的野生型(ws)、异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体(gpa1-1,gpa1-2)和超表达突变体(wGα,cGα)为材料,在含有不同质量浓度(0~0.2 mg/L)NAA的培养基内,添加无机钙通道抑制剂AlCl3,对拟南芥侧根生长发育的形态进行观测,并对NAA、Ca2+、AlCl3的影响作用大小进行递进因子分析。【结果】相同质量浓度的NAA对5种基因型拟南芥侧根的生长发育无显著影响;Ca2+对5种基因型拟南芥侧根生长发育均有显著影响,侧根数目依次为缺失突变体<野生型<超表达突变体;AlCl3对5种基因型拟南芥侧根生长发育影响显著;Ca2+和AlCl3是拟南芥侧根生长发育的重要影响因素。【结论】(1)Ca2+通道可能是异三聚体G蛋白α亚基调节的下游效应器,Ca2+可能是下游信号,AlCl3对细胞膜上的Ca2+通道阻断数量可能是按一定比例阻断,而不是一个绝对数量,机制尚不明确。(2)3个处理因素在不同的处理层次中所起的作用不同,对5种不同基因型拟南芥个体侧根生长的影响也不同。递进因子分析结果与实际情况基本一致,是一种科学的、可行的、有创新性的方法,值得推广应用。

关键词：拟南芥异三聚体G蛋白突变体递进因子分析

海南龙血树4个DcTIFY10转录因子的鉴定和表达分析

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分子植物育种 2019年第19期17卷 6287-6294页

作者：丁旭坡马纳纳庞宽壮蔡彩虹戴好富梅文莉中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业农村部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海口571101 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南省黎药天然产物研究与利用重点实验室海口571101 海南大学热带农林学院海口570228

TIFY家族是陆生植物特有的基因家族,而TIFY10/JAZ则是植物茉莉酸信号转导的关键调控因子。本研究在海南龙血树(Dracaena cambodiana)转录组数据基础上,利用生物信息学方法首次鉴定了4个编码177~246个氨基酸的海南龙血树DcTIFY10基因,4个... 详细信息

TIFY家族是陆生植物特有的基因家族,而TIFY10/JAZ则是植物茉莉酸信号转导的关键调控因子。本研究在海南龙血树(Dracaena cambodiana)转录组数据基础上,利用生物信息学方法首次鉴定了4个编码177~246个氨基酸的海南龙血树DcTIFY10基因,4个DcTIFY10蛋白具有TIFY10的特征性ZIM和Jas结构域,与水稻、拟南芥的TIFY10具有较高的同源性,与水稻OsTIFY10基因家族具有较近的亲缘关系,4个DcTIFY10蛋白均无跨膜结构域,分别包含20~30个磷酸化位点,蛋白二级结构主要有α螺旋和无规则卷曲为主;4个DcTIFY10基因在海南龙血树根或者茎中的表达量最高,在血竭诱导生成过程中持续上调表达,与血竭的生成部位和形成时间呈现出一致性,说明其在血竭生成过程中发挥着重要的作用,此结果为进一步研究茉莉酸信号途径在海南龙血树生长发育和血竭形成过程中的作用提供了技术支持。

关键词：海南龙血树(Dracaena cambodiana) TIFY10 转录因子生物信息学表达分析

双酚P暴露造成C57BL/6小鼠肠道微生物紊乱并通过LPS/TLR4/NF-κB通路引起肠道炎症及屏障损伤

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双酚P暴露造成C57BL/6小鼠肠道微生物紊乱并通过LPS/TLR4/NF-κB...

重组米曲霉丝氨酸羧肽酶O的性质鉴定及脱苦应用研究

中国毒理学会第十次全国毒理学大会

作者：马纳纳马雕刘霞赵立宁马蕾马丹董四君河北大学生命科学学院

目的双酚A(BPA)是全球生产及使用量最高的化学品之一,但具有广泛的毒性。双酚P(BPP,4,4′-(1,4-苯二异丙基)双酚)因具有很多优良的性能而被广泛用作BPA的替代品之一,已经在多种环境及人体中被检测到。饮食暴露是BPP暴露人体的最主要方式... 详细信息

目的双酚A(BPA)是全球生产及使用量最高的化学品之一,但具有广泛的毒性。双酚P(BPP,4,4′-(1,4-苯二异丙基)双酚)因具有很多优良的性能而被广泛用作BPA的替代品之一,已经在多种环境及人体中被检测到。饮食暴露是BPP暴露人体的最主要方式,但是它是否对肠道菌群及肠道屏障的造成影响仍不清楚。因此本研究通过三批动物实验,采用层层推进的验证方式,目的是验证不同暴露时长和不同浓度BPP通过饮食暴露对肠道微生物菌群组成及群落结构的影响,以及对肠道屏障功能造成的影响及作用机制进行探究。材料方法本研究通过对小鼠粪菌微生物16S rRNA测序和生物信息学分析,回肠和结肠组织病理学分析(苏木精和伊红染色,AB-PAS染色),血清及粪菌ELSA相关指标测定,RNA提取和实时荧光定量PCR(RT-qPCR),蛋白质印迹法(WB),回肠和结肠组织巨噬细胞的免疫荧光分析,肠道细菌荧光原位杂交(FISH)等方法确保实现该研究目的。结果第一批用Control,BPP(30μg/kg bw/day)组暴露C57BL/6小鼠9周,发现BPP组与对照组相比,体重增加,肠道微生物种群受到干扰。初步探索了BPP的长期暴露对小鼠体重及肠道微生物的影响;第二批动物实验,用NC,L(0.3μg/kg bw/day BPP),M(30μg/kg bw/day BPP),H(3000μg/kg bw/day BPP)暴露C57BL/6小鼠5周,与NC组相比,M和H组肠道微生物,体重发生显著变化。粪便中脂多糖(LPS)的过度产生,进而激活LPS/TLR4/NF-κB信号通路引发炎症反应,减少粘液的分泌和紧密连接蛋白的表达,显著增加肠道通透性,促进细菌移位导致肠道屏障破坏。探索了不同浓度BPP暴露评测目前环境水平及更大剂量浓度下对肠道微生物及肠道屏障功能的影响;第三批动物实验,用抗生素组合消除肠道微生物后,血清中脂多糖(LPS)的含量显著降低,肠道炎症及损伤都有所缓解,进步验证BPP暴露对机体肠道微生物及其肠道屏障的作用机制。结论一定浓度的BPP经口暴露能够造成小鼠肠道微生物紊乱,并通过LPS/TLR4/NF-κB通路引发肠道炎症及肠道屏障破坏。该研究将为BPP使用和管控提供参考数据,为BPP与人类疾病预防提供新见解。

关键词： BPP BPA类似物微生物菌群肠道炎症屏障功能

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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广东农业科学 2015年第5期42卷 103-108页

作者：陈丹游子娟黄伟谦马纳纳罗晓春华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006

为了研究羧肽酶在蛋白水解及对蛋白水解物脱苦中的重要作用,利用毕赤酵母表达系统对米曲霉（Asperigillus oryzae）羧肽酶O（carboxypeptidase O,Ocp O）进行表达。重组米曲霉羧肽酶O（r Ocp O）经过分子筛和离子柱纯化,对其进行脱糖基... 详细信息

为了研究羧肽酶在蛋白水解及对蛋白水解物脱苦中的重要作用,利用毕赤酵母表达系统对米曲霉（Asperigillus oryzae）羧肽酶O（carboxypeptidase O,Ocp O）进行表达。重组米曲霉羧肽酶O（r Ocp O）经过分子筛和离子柱纯化,对其进行脱糖基化及酶学性质的检测研究。结果表明,该蛋白酶是以糖蛋白的形式进行表达,分子量约为74 ku,脱糖基化后的相对分子质量约为56 ku,产量约为20.4 n Kat/m L。该蛋白酶是一种酸性蛋白酶,最适p H值为4.0,且在p H 3.0～6.0时保持稳定;最适温度约为40℃,具有良好的热稳定性,在60℃孵育1 h后仍能保持63%的酶活;PMSF能够显著抑制该酶酶活,证明其为丝氨酸羧肽酶。通过r Ocp O对大豆蛋白和酪蛋白的Alcalase蛋白酶水解物的进一步水解研究发现,r Ocp O水解对两种水解液的苦味均有明显减轻,并且水解度有明显升高。

关键词：米曲霉重组羧肽酶O 酶学性质脱苦

一种新颖的毕赤酵母酸性蛋白酶基因的克隆和异源表达以及酶学性质研究

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广东农业科学 2015年第12期42卷 141-146页

作者：马纳纳徐冬冬黄伟谦游子娟罗晓春华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006

采用基因克隆方法获得酸性蛋白酶基因,在毕赤酵母KM71表达系统中进行表达,并将重组酵母酸性蛋白酶r Pr A经过浓缩后研究其酶学性质,初步探究了r Pr A对大豆蛋白和酪蛋白的水解情况。结果表明:经过异源表达后的重组毕赤酵母酸性蛋白酶分... 详细信息

采用基因克隆方法获得酸性蛋白酶基因,在毕赤酵母KM71表达系统中进行表达,并将重组酵母酸性蛋白酶r Pr A经过浓缩后研究其酶学性质,初步探究了r Pr A对大豆蛋白和酪蛋白的水解情况。结果表明:经过异源表达后的重组毕赤酵母酸性蛋白酶分子量约为44 ku,在p H3.0的发酵条件下酶活最高,可达46.92U/m L。该酸性蛋白酶的最适p H值为3.0,最适温度为35℃。Mn2+对该酶活性有激活作用,多种金属离子对该酶有抑制作用;0.1 mmol/L的Pepstain A即可完全抑制酶活,说明此重组酶的活性中心有天冬氨酸残基。对大豆蛋白和酪蛋白的初步水解试验可知,当E/S为4 000 U/g时,此重组酶对大豆分离蛋白和酪蛋白的水解度分别为9.0%和8.34%。优化发酵条件以及与多种蛋白酶进行复配,该重组蛋白酶将在蛋白水解中有很好的应用前景,有望应用到畜禽饲料加工行业。

关键词：毕赤酵母重组酵母酸性蛋白酶酶学性质蛋白水解

重组米曲霉中性蛋白酶(rNpI)水解大豆蛋白苦味及其抗氧化性研究

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广东农业科学 2015年第10期42卷 84-88页

作者：游子娟钟丽芬黄伟谦马纳纳罗晓春华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006

为探讨重组中性蛋白酶rNpI对大豆蛋白的水解、水解产物的苦味及产物抗氧化性的影响,进行水解度测定、水解产物苦味值感官评定,以及水解产物清除DPPH自由基能力、还原能力、和氧自由基清除能力测定。结果表明,重组米曲霉rNpI对大豆蛋白... 详细信息

为探讨重组中性蛋白酶rNpI对大豆蛋白的水解、水解产物的苦味及产物抗氧化性的影响,进行水解度测定、水解产物苦味值感官评定,以及水解产物清除DPPH自由基能力、还原能力、和氧自由基清除能力测定。结果表明,重组米曲霉rNpI对大豆蛋白有较高的水解度,当酶与底物比（E/S）为1000、4000、8000U/g时,水解度分别为7.8%、11.5%和16.0%。对其水解产物进行苦味评价,结果发现,r Np1大豆蛋白水解产物苦味值明显比Alcalase的水解产物低。不同的抗氧化方法测定水解产物的抗氧化活性表明,r Np1对大豆蛋白的水解产物具有较高的清除DPPH自由基能力、还原能力和氧自由基清除能力。通过超滤的方法对E/S为4000U/g的水解产物进行分离,得到分子量〉10ku、3-10ku和〈3ku的组分,分别测定其抗氧化性,发现抗氧化性能力与肽的分子量大小有关。重组米曲霉rNpI对植物蛋白有很高的水解效率,其水解产物苦味值低且具有较高的抗氧化性,在食品、饲料等行业有很好的应用前景。

关键词：重组中性蛋白酶水解度苦味值抗氧化性

企业“云化贯通”数字化税务风险管控探究——基于金税四期背景

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财会通讯 2025年第4期 134-139页

作者：高小纳吉林警察学院吉林长春130123

金税四期建设应用实现了税务系统全行业闭环,企业传统税务风险管理模式所发挥的作用逐渐减弱,文章旨在探讨企业数字化转型下贯通“业务云”“财务云”“税务云”的“云化贯通”数字化税务风险管控体系,以案例方式对体系实践进行探讨,以... 详细信息

金税四期建设应用实现了税务系统全行业闭环,企业传统税务风险管理模式所发挥的作用逐渐减弱,文章旨在探讨企业数字化转型下贯通“业务云”“财务云”“税务云”的“云化贯通”数字化税务风险管控体系,以案例方式对体系实践进行探讨,以期为国内企业在金税四期全面推动下的税务风险管控提供借鉴。

关键词：金税四期数字化税务风险风险管控云化贯通