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高效降解羽毛的微白黄链霉菌Fea-10的分离鉴定及其角蛋白酶基因的异源表达

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高效降解羽毛的微白黄链霉菌Fea-10的分离鉴定及其角蛋白酶基因的...

作者：马怡茗西北农林科技大学

学位级别：硕士

角蛋白酶(keratinase)是一类可以降解顽固的角蛋白(如羽毛、羊毛、头发等)的蛋白酶,广泛存在于自然界中。角蛋白酶一般可以分类为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。由于角蛋白不能被普通的蛋白酶降解,且数量巨大,每年都会有数百万吨的含角蛋... 详细信息

角蛋白酶(keratinase)是一类可以降解顽固的角蛋白(如羽毛、羊毛、头发等)的蛋白酶,广泛存在于自然界中。角蛋白酶一般可以分类为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。由于角蛋白不能被普通的蛋白酶降解,且数量巨大,每年都会有数百万吨的含角蛋白废弃物产生,但是它们并不会在自然界中堆积,这种要是角蛋白降解微生物产生的角蛋白酶将这些废弃物分解,从而减轻了环境的负担。目前,已知细菌、真菌和放线菌中均有可以产生角蛋白酶的菌株,古细菌中也有可以产生角蛋白酶的报道。角蛋白降解微生物可以利用廉价的角质废弃物作为培养基质来产生角蛋白酶,使得角蛋白酶具有较低的生产成本,且角蛋白酶在各种工业领域具有很好的应用,具有很高的利用价值。本文在养鸡场堆积羽毛的土壤中,分离得到了一株角蛋白降解菌Fea-10。经过初步鉴定,Fea-10为微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus。Fea-10具有很高的角蛋白酶活性,可以完整的降解羽毛。通过已知的角蛋白酶的N端序列,在Fea-10基因组中找到两个可能的角蛋白酶基因gm2886和gm2888。这两个基因均由信号肽、前肽和成熟酶三个部分构成。将这两个基因的完整基因分别构建在pET15b-SUMO载体上,转入BL21(DE3)均不能表达;更换为pET28a载体和Rossta(DE3)宿主后,只有gm2888可以获得无活性的包涵体表达;将这两个基因去掉信号肽的酶原基因分别构建在pET22b载体上,转入Rossta(DE3),只有2886可以获得可溶性表达,但并没有角蛋白酶活性。考虑到可能链霉菌表达系统更适于链霉菌来源的角蛋白酶表达并折叠为有活性的成熟酶,使用链霉菌-大肠杆菌穿梭整合型质粒pSET152进行表达。表达宿主菌选择微弱角蛋白酶活的密旋链霉菌ACT12。构建gm2886带有原始启动子和红霉素启动子的表达载体和gm2888带有红霉素启动子的表达载体,分别接合转移导入ACT12。使用牛奶平板初筛接合子,并使用TSBY培养基发酵降解圈大的接合子,使用硫酸铵沉淀后,检测只有gm2886带红霉素的载体有角蛋白酶表达。使用Ni柱纯化重组蛋白,并测定其酶学性质。重组蛋白的最适温度为50℃,最适pH10.0,在40℃保温30 min后酶活仍有80%以上。金属离子Ca、Mg、K均抑制重组蛋白的活性;PMSF显著抑制重组蛋白的活性,重组蛋白为丝氨酸蛋白酶。重组蛋白对可溶的casein、Azo-casein、BSA和hemoglobin以及不可溶的羽毛和天青角蛋白均有活性。

关键词：角蛋白酶微白黄链霉菌Fea-10 密旋链霉菌ACT12 异源表达

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新型β-琼胶酶AgaB的定向进化

新型β-琼胶酶AgaB的定向进化

作者：马怡茗中国海洋大学

学位级别：硕士

琼胶酶AgaB是本试验室从海洋假别单胞菌CY24中克隆得到的一个新颖的胞外琼胶酶。研究表明AgaB是一个结构和功能全新的β-琼胶酶,降解琼脂糖的主要产物为新琼八糖和十糖,最小底物为十二糖,作用机制为倒位型,在家族划分上该酶不属于任何... 详细信息

琼胶酶AgaB是本试验室从海洋假别单胞菌CY24中克隆得到的一个新颖的胞外琼胶酶。研究表明AgaB是一个结构和功能全新的β-琼胶酶,降解琼脂糖的主要产物为新琼八糖和十糖,最小底物为十二糖,作用机制为倒位型,在家族划分上该酶不属于任何一个已知的糖苷水解酶家族,这些都不同于已发现的其它琼胶酶。AgaB结构上的新颖性和功能上的特异性决定了它在工业和药用方面拥有潜在的应用价值。但是AgaB较低的温度稳定性(在高于35°C的情况下容易失去酶的活性)限制了它在工业上的更大规模的应用。实验室前期工作建立了耐热性明显提高的突变株M446,但其催化活性相比于野生型下降了20%。本论文旨在通过定向进化的方法,在保持M446耐热性的前提下提高其催化活性。定向进化的两个关键步骤是建立分子的多样性文库和高通量筛选体系。本文采用易错PCR和化学诱变来建立分子的多样性,以组成型表达载体pBS-ks(sv)作为载体建立突变体文库。易错PCR引起的碱基突变多发生在胸腺嘧啶和腺嘌呤位点,而化学诱变剂甲基磺酸乙酯主要引起鸟嘌呤位点的突变,在一定程度上弥补了易错PCR的不足。根据琼胶酶水解琼胶引起琼胶液化在平板上产生透明水解圈,而且相对酶活较高的突变株在平板上形成较大的水解圈的特性建立了高通量筛选体系。突变菌株在37°C下过夜培养,筛选水解圈/菌落克隆直径大于野生型菌的克隆,作为研究对象进行发酵液上清和纯酶水平上的进一步鉴定。最终我们获得了一个热稳定性和产物性质没有改变而比活力为M446 3倍的突变株,命名为M117。测序结果表明,M117发生了四处碱基替代,其中两处引起了氨基酸替代,分别是Arg9→Lys,Ile111→Val,另两处为无义突变。其中第9位的氨基酸突变存在于信号肽区域,该区域在蛋白质跨膜转运的时候被切除,对成熟酶的比活力没有影响,由此,可以推断引起突变株M117比活力提高的主要原因是第111位氨基酸的突变。为了推测突变株M117催化活性提高的机制,我们分别测定了M117与M446的动力学常数,结果表明,突变株M117的Km值比M446降低了14倍,而其Kcat值变化不明显。由此可以推断,突变株M117催化活性提高的主要原因是酶与底物的结合能力增强。实验中发现的氨基酸替代为缬氨酸替代了异亮氨酸,二者均为疏水性氨基酸,但是缬氨酸的侧链基团比异亮氨酸的小,推测第111位的氨基酸可能位于底物结合位点附近或者属于底物结合位点的一部分,而短的侧链基团对底物进入催化腔的空间位阻比较小,有利于底物与底物结合位点的结合。另一方面,因为异亮氨酸与缬氨酸的性质比较类似,所以这种替换没有造成突变株M117其它性质的改变。综上所述,应用定向进化方法,我们得到了一个既保持了耐热性和产物特性,又提高了催化活性的突变株M117。其进一步提高的催化活性,将会使突变株M117在食品、化妆品和医药方面得到更大规模的应用。此外,由于序列和结构的新颖性,使得AgaB三维结构的确定非常困难,而突变株M117的获得对于确定AgaB的结构具有重要的指导意义。

关键词：琼胶酶定向进化催化活性易错PCR 化学诱变

利用pTet-Off系统研究NAIF1对食管癌细胞系EC9706生物学行为的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2011年第2期27卷 162-165页

作者：罗清钟佳玲赵玫马怡茗刘健王佳黄常志中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所病因及癌变研究室癌发生及预防分子机理北京市重点实验室分子肿瘤学国家重点实验室北京100021

目的:利用pTet-off可诱导表达系统将NAIF1重组质粒导入食管癌EC9706中进行生物学行为影响研究。方法:构建pTRE2-NAIF1质粒,与PTK-Hyg质粒共转染入可诱导表达细胞系TF93(由EC9706构建而得),经筛选并鉴定获得稳定可诱导表达克隆。以此克... 详细信息

目的:利用pTet-off可诱导表达系统将NAIF1重组质粒导入食管癌EC9706中进行生物学行为影响研究。方法:构建pTRE2-NAIF1质粒,与PTK-Hyg质粒共转染入可诱导表达细胞系TF93(由EC9706构建而得),经筛选并鉴定获得稳定可诱导表达克隆。以此克隆采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞术(FCM)检测细胞周期、Transwell小室法检测细胞迁移和检测细胞黏附能力的改变。结果:经筛选并鉴定获得了稳定的可诱导表达TF93-pTRE2-NAIF1克隆。NAIF1在体外可以抑制EC9706细胞增殖、导致G0/G1期细胞阻滞、抑制其迁移和黏附能力。结论:NAIF1能抑制食管癌细胞系EC9706的恶性生物学行为,为食管癌的基因治疗提供了可能的新靶点。

关键词： NAIF1 食管癌 EC9706 pTet-Off可诱导表达系统

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β-琼胶酶AgaB催化活性的定向进化

高技术通讯 2008年第2期18卷 206-210页

作者：马怡茗路新枝石超马翠萍于文功中国海洋大学医药学院青岛266003

用体外定向进化技术提高了β-琼胶酶 AgaB 热稳定突变酶 M446的催化活性。采用易错 PCR 和化学诱变法相结合的方法,构建了 M446的突变体文库;利用琼胶酶降解琼胶在平板上产生水解圈的特性,建立了阳性克隆的高通量筛选体系。最终筛选得... 详细信息

用体外定向进化技术提高了β-琼胶酶 AgaB 热稳定突变酶 M446的催化活性。采用易错 PCR 和化学诱变法相结合的方法,构建了 M446的突变体文库;利用琼胶酶降解琼胶在平板上产生水解圈的特性,建立了阳性克隆的高通量筛选体系。最终筛选得到酶活性得到提高且保持较高耐热性的突变酶 M117,其酶活提高为突变酶 M446的3倍。测序分析发现编码突变酶 M117的 DNA 序列中有4处点突变,其中2处为同义突变,另外2处引发氨基酸替换,分别为 R9K 和 I111V。对突变酶 M117与 M446的动力学常数进行了比较,发现 M117的 Km 值降低了93.4%,Kcat/Km 值提高了15倍,由此可以推断突变酶M117比活力提高的主要原因是酶与底物的亲和能力提高。

关键词：定向进化易错PCR 化学诱变酶活力 β-琼胶酶

人细胞核诱导凋亡因子1在大肠杆菌中的表达、纯化及多克隆抗体制备

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第1期26卷 56-58页

作者：罗清赵玫时岚马怡茗钟佳玲黄常志中国医学科学院/北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所病因室分子肿瘤学国家重点实验室癌发生及预防分子机理北京市重点实验室北京100021

目的:构建人核凋亡诱导因子1(NAIF1)原核表达质粒,在大肠杆菌中表达及纯化NAIF1融合蛋白,制备兔抗NAIF1多克隆抗体,并对其特性进行初步鉴定。方法:PCR法获得人NAIF1序列并将其克隆到原核表达载体pET-32a中,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(D... 详细信息

目的:构建人核凋亡诱导因子1(NAIF1)原核表达质粒,在大肠杆菌中表达及纯化NAIF1融合蛋白,制备兔抗NAIF1多克隆抗体,并对其特性进行初步鉴定。方法:PCR法获得人NAIF1序列并将其克隆到原核表达载体pET-32a中,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达蛋白,经变性、Ni+柱亲和纯化、复性后得到纯化的重组人NAIF1蛋白,免疫大耳白兔,制备兔抗人NAIF1多抗血清,以ELISA和Westernblot方法检测其效价和特异性。结果:成功获得了高纯度的人NAIF1重组蛋白和高效价的兔抗人NAIF1多抗血清,ELISA检测多抗效价达到1∶500000,Westernblot检测证明多抗特异性良好。结论:获得了高纯度的人NAIF1重组蛋白和兔抗人NAIF1多抗血清,为后续针对NAIF1基因功能的研究提供了重要实验材料。

关键词： NAIF1 原核表达蛋白纯化多克隆抗体

环指蛋白152对NO诱导结肠癌细胞凋亡的影响

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中华肿瘤杂志 2021年第5期43卷 528-532页

作者：赵新华马怡茗李伟伟汪红英国家癌症中心国家肿瘤临床医学研究中心中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室100021

目的探讨环指蛋白152(RNF152)在结肠炎相关结肠癌(CAC)发生发展过程中的作用及其作用机制。方法联合应用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导C57BL/6小鼠,建立CAC发生发展4个阶段(分别为正常上皮组织、炎症恢复期、轻度不典型增... 详细信息

目的探讨环指蛋白152(RNF152)在结肠炎相关结肠癌(CAC)发生发展过程中的作用及其作用机制。方法联合应用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导C57BL/6小鼠,建立CAC发生发展4个阶段(分别为正常上皮组织、炎症恢复期、轻度不典型增生、腺癌)的小鼠模型。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测不同阶段小鼠结肠组织中RNF152 mRNA的表达。利用人结直肠癌RKO细胞建立稳定高表达RNF152的细胞系。采用流式细胞术检测RNF152高表达对细胞凋亡的影响,Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达。使用NO自由基供体DETA NONOate处理细胞,比较RNF152高表达对NO诱导细胞凋亡的影响。结果AOM和DSS联合使用能有效地模拟人类CAC的病程,AD3组小鼠成瘤率为100%。CAC小鼠模型的结肠全基因组表达谱芯片显示,RNF152 mRNA的表达水平随着结肠癌的发生发展逐步降低。RT-qPCR检测结果显示,腺癌组结肠组织中RNF152 mRNA的表达水平为1.23±0.18,高于对照组结肠组织(0.52±0.08,P<0.01)。RNF152稳定高表达的RKO-RNF152细胞中,sub-G1期细胞比例[(3.6±0.4)%]高于RKO-PCDB细胞[(1.8±0.1)%,P<0.01],Bcl-XL和Bcl-2的蛋白表达水平明显下调。DETA NONOate处理后,RKO-RNF152细胞的凋亡比例为(31.2±3.1)%,高于RKO-PCDB细胞[(14.2±2.1)%,P<0.001]。结论RNF152的表达降低与CAC的发生发展有关,可能通过抑制细胞凋亡促进了CAC的发生发展。

关键词：结肠肿瘤环指蛋白152 凋亡一氧化氮

蛋白酶活化受体2在卵巢上皮性癌中的表达及意义

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中华肿瘤杂志 2023年第1期45卷 64-73页

作者：刘双环马怡茗张亚男赵新华汪红英李斌国家癌症中心、国家肿瘤临床医学研究中心、中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院妇科北京100021 国家癌症中心、国家肿瘤临床医学研究中心、中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室北京100021

目的探讨蛋白酶活化受体2(PAR2)在卵巢上皮性癌中的表达及意义。方法收集癌症基因组图谱(TCGA)数据库(410例卵巢上皮性癌患者)和组织基因型表达(GTEx)数据库(88例正常人)中PAR2 mRNA的表达水平。收集2009—2019年于中国医学科学院肿瘤... 详细信息

目的探讨蛋白酶活化受体2(PAR2)在卵巢上皮性癌中的表达及意义。方法收集癌症基因组图谱(TCGA)数据库(410例卵巢上皮性癌患者)和组织基因型表达(GTEx)数据库(88例正常人)中PAR2 mRNA的表达水平。收集2009—2019年于中国医学科学院肿瘤医院接受手术治疗卵巢癌患者(149例)的癌组织及临床病理资料,对患者肿瘤组织进行PAR2蛋白免疫组化染色,分析PAR2 mRNA及蛋白表达与临床病理特征及预后的关系,通过富集分析研究PAR2参与的基因功能及相关信号通路。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log rank检验,影响因素分析采用Cox比例风险回归模型。结果 TCGA和GTEx数据库结果显示,卵巢上皮性癌组织中PAR2 mRNA的表达水平(3.05±0.72)高于正常卵巢组织(0.33±0.16,P=0.004)。149例患者的免疫组化结果显示,PAR2呈强阳性19例,阳性77例,弱阳性21例,阴性32例。初始手术减瘤效果及初始治疗效果与PAR2 mRNA及PAR2蛋白的表达有关(均P<0.05)。PAR2 mRNA高表达组(PAR2 mRNA≥0.88)患者的中位无进展生存时间(14.9个月)低于低表达组(PAR2 mRNA<0.88;17.1个月,P=0.033);PAR2 mRNA高表达组患者的中位总生存时间(36个月)低于低表达组(40个月,P=0.011)。多因素分析显示,初始手术减瘤效果、初始治疗效果是无进展生存和总生存的独立影响因素(均P<0.05)。PAR2蛋白高表达组(PAR2≥0.90)患者的中位无进展生存时间(6.5个月)低于PAR2蛋白低表达组(PAR2<0.90;9.5个月,P=0.016)。PAR2高表达组患者的中位总生存时间(43个月)低于低表达组(55个月,P=0.038)。多因素分析显示,PAR2蛋白表达水平、初始手术减瘤效果、化疗耐药是无进展生存和总生存的独立影响因素(均P<0.05)。基因本体论(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析显示,PAR2的靶基因主要富集于细胞间连接相关的功能上,占40.0%(6/15)。基因富集分析表明,在PAR2 mRNA高表达卵巢癌患者中Wnt/β-catenin信号通路(P=0.023)、MAPK通路(P=0.029)及糖酵解相关通路(P=0.018)存在富集。结论 PAR2表达与卵巢癌初始手术满意减瘤、初始治疗效果及患者预后有关,PAR2可能参与Wnt/β-catenin信号通路调控细胞间连接来促进卵巢癌侵袭及转移。

关键词：卵巢恶性肿瘤蛋白酶活化受体2 癌症基因组图谱数据库减瘤手术预后 Wnt信号通路

miR-181b在结肠炎相关结肠癌发生过程中的表达

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胃肠病学 2016年第4期21卷 206-210页

作者：贺龙梅赵新华马怡茗汪红英国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室 100021

背景:miR-181b与多种肿瘤的形成相关,但其在结肠炎相关结肠癌中的表达情况尚不明确。目的:探索miR-181b在结肠炎相关结肠癌发生过程中的变化,并初步筛选其下游可能的靶基因。方法:联合使用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)制备结... 详细信息

背景:miR-181b与多种肿瘤的形成相关,但其在结肠炎相关结肠癌中的表达情况尚不明确。目的:探索miR-181b在结肠炎相关结肠癌发生过程中的变化,并初步筛选其下游可能的靶基因。方法:联合使用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)制备结肠炎相关结肠癌小鼠模型。以实时荧光定量PCR(qP CR)检测不同时期小鼠结肠组织miR-181b表达。利用全基因组表达谱芯片结合miRNA靶基因预测软件TargetS can、PicTar和miRDB初步预测miR-181b的下游靶基因,并以qPCR法检测结肠炎相关结肠癌小鼠中靶基因的表达。结果:miR-181b表达在结肠炎相关结肠癌形成过程中逐渐升高,但单独使用AOM或DSS均不会改变miR-181b水平。结合全基因组表达谱芯片和miRNA靶基因预测软件初步筛选出miR-181b可能的下游靶基因为Ipmk、E2f5、Klf6、Prkcd、Bai3和Hic2,qPCR法显示Ipmk、Prkcd、Bai3、Hic2表达明显低于对照组。结论:miR-181b表达随结肠炎相关结肠癌的发展而升高,该变化与单纯慢性炎症无关。

关键词： miR-181b 结肠肿瘤结肠炎

酪氨酸和苏氨酸蛋白激酶在结直肠癌发生发展中的表达变化及其与预后的关系

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中华肿瘤杂志 2017年第3期39卷 172-177页

作者：张小利韩文晓马怡茗包韩乌云赵新华汪红英北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室 100021

摘要目的探讨酪氨酸和苏氨酸蛋白激酶（TTK）在结直肠癌发生发展中的表达变化及与结直肠癌患者预后的关系。方法联合应用氧化偶氮甲烷（AOM）和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导C57BL/6小鼠发生结肠炎相关的结肠癌，得到结肠癌发生发展的4个不... 详细信息

摘要目的探讨酪氨酸和苏氨酸蛋白激酶（TTK）在结直肠癌发生发展中的表达变化及与结直肠癌患者预后的关系。方法联合应用氧化偶氮甲烷（AOM）和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导C57BL/6小鼠发生结肠炎相关的结肠癌，得到结肠癌发生发展的4个不同阶段的小鼠模型（分别为炎症恢复期、轻度不典型增生、腺瘤、腺癌），同时设立无任何处理的对照组。应用实时荧光定量PCR和免疫组化法检测不同阶段小鼠结肠和24对结直肠癌及其配对的癌旁组织中TTK mRNA和蛋白的表达水平。从美国国家生物技术信息中心（NCBI）基因表达公共数据库中获取结直肠癌全基因组芯片数据，分析TTK的表达与结直肠癌患者预后的关系。结果AOM-DSS结肠癌小鼠模型的结肠全基因组表达芯片显示，TTK mRNA的表达水平随着结肠癌的发生发展逐渐升高。实时荧光定量PCR检测结果显示，对照组、炎症恢复期、轻度不典型增生、腺瘤和腺癌小鼠结肠组织中TTK mRNA的表达水平分别为1.05±0.42、1.10±0.03、1.38±0.15、1.33±0.17和2.12±0.22，轻度不典型增生、腺瘤和腺癌小鼠结肠组织中TTK mRNA的表达水平均明显高于对照组（均P〈0.05）。免疫组化检测对照组、炎症恢复期、轻度不典型增生、腺瘤和腺癌小鼠结肠组织中TTK蛋白的表达变化与TTK mRNA的检测结果一致。24例结直肠癌患者肿瘤组织中TTK mRNA的表达水平为0.71±0.10，明显高于配对的癌旁组织（0.18±0.04，P〈0.001）。免疫组化检测5例结直肠癌患者肿瘤组织中TTK蛋白的阳性表达率为80.0%，明显高于配对的癌旁组织（30.8%，P＝0.014）。全基因组芯片网络数据（GSE17536）分析显示，TTK的高表达与结直肠癌患者的不良预后有关。结论在结肠癌的小鼠模型中，TTK的表达随着肿瘤的发生发展逐渐升高；在临床结直肠癌标本中，TTK的高表达与患者的不良预后相关。

关键词：酪氨酸和苏氨酸蛋白激酶结直肠肿瘤 AOM-DSS结肠癌小鼠模型预后