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肠道病毒71型类病毒颗粒在汉逊酵母中的表达及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2015年第9期28卷 906-911页

作者：李国顺郭林方玉松陈磊张盼徐颖之王凤伟顾美荣魏文进郑海发北京民海生物科技有限公司研发中心北京102600

目的于汉逊酵母中表达肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)类病毒颗粒(virus-like particle,VLP),并分析其免疫原性。方法将鉴定正确的重组质粒p MV-P1-3CD转化汉逊酵母AU0501,经筛选获得稳定整合P1和3CD基因的重组菌株p MV-P1-3CD/AU。3... 详细信息

目的于汉逊酵母中表达肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)类病毒颗粒(virus-like particle,VLP),并分析其免疫原性。方法将鉴定正确的重组质粒p MV-P1-3CD转化汉逊酵母AU0501,经筛选获得稳定整合P1和3CD基因的重组菌株p MV-P1-3CD/AU。30 L发酵罐培养重组菌株,发酵产物纯化后进行SDS-PAGE、Western blot、HPLC检测、电镜分析及动态光散射分析检测。采用不同方法制备EV71疫苗,分别免疫小鼠和家兔,检测动物血清中和抗体几何平均滴度(GMT),评价其免疫原性及不同佐剂对疫苗免疫原性的影响。结果重组菌株p MV-P1-3CD/AU表达产物及疫苗原液的SDS-PAGE分析显示,于相对分子质量26 000、33 000和35 000处均可见VP3、VP1和VP0蛋白条带,且相对分子质量33 000的蛋白可与EV71-VP1单克隆抗体发生特异性结合;疫苗原液的纯度达99%以上;电镜观察可见30 nm的VLP,颗粒均一度较好;小鼠血清GMT最高可达1 536,家兔血清GMT最高可达586,磷酸铝佐剂及氢氧化铝佐剂均可明显提高小鼠血清GMT。结论于汉逊酵母中成功实现EV71的P1和3CD基因的共表达,可形成EV71 VLP,且具有良好的免疫原性,为今后EV71 VLP疫苗的研制提供了实验依据。

关键词：肠道病毒71型类病毒颗粒汉逊酵母免疫原性

肠道病毒71型病毒样颗粒在汉逊酵母中的表达

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中华微生物学和免疫学杂志 2013年第8期33卷 604-609页

作者：顾美荣宋琳琳许珊珊付作申林福玉张现臣魏文进贾士儒天津科技大学生物工程学院 300457 北京民海生物科技有限公司研发中心 102600

目的应用汉逊酵母表达系统进行肠道病毒71型（EV71）病毒样颗粒（VLP）的表达。方法将经过汉逊酵母密码子优化的人EV71的P1和3CD基因片段克隆到汉逊酵母表达载体PMV上，获得重组表达质粒PMV．P1-3CD，转化汉逊酵母宿主菌AU0501，PCR方... 详细信息

目的应用汉逊酵母表达系统进行肠道病毒71型（EV71）病毒样颗粒（VLP）的表达。方法将经过汉逊酵母密码子优化的人EV71的P1和3CD基因片段克隆到汉逊酵母表达载体PMV上，获得重组表达质粒PMV．P1-3CD，转化汉逊酵母宿主菌AU0501，PCR方法及稳定传代培养筛选整合P1和3CD基因的重组菌株。重组菌种接种在含有1％甲醇的培养基中进行诱导表达，对表达产物进行***、Western blot检测。挑选优胜表达菌株进行30L发酵罐发酵培养，发酵产物经过粗略纯化后进行电镜分析。结果筛选获得EV71重组表达菌株；SDS-PAGE检测结果显示在相对分子质量（M，）为26×10^3、33×10^3、35×10^3处有明显的VP3、VP1、VP0蛋白条带，M大小与预期的目的蛋白大小一致；Western blot检测结果显示表达产物与EV71-VP1单克隆抗体在犯为33×10^3处有较为明显的VPl反应条带，表达产物具有良好的免疫反应性；表达菌株发酵表达量可达200mg／L，电镜分析可见24～30nin的VLP，且颗粒结构完好。结论应用汉逊酵母表达系统成功表达了EV71VLP，为今后研制EV71VLP疫苗奠定基础。

关键词：肠道病毒71型汉逊酵母病毒样颗粒表达

戊型肝炎病毒Ⅳ型ORF2蛋白在汉逊酵母中的表达

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生物工程学报 2007年第1期23卷 73-78页

作者：苏彩霞顾美荣张萍金贞姬孟凡红陈尔佳杨喆刘勇王佑春大连汉信生物制药有限公司技术开发部大连116600 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心中国药品生物制品检定所细胞室北京100050

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗,利用甲基营养型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)系统表达戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)Ⅳ型结构区ORF2编码蛋白第112-607氨基酸片段。为实现目的基因在汉逊酵母中的高效表达,根据... 详细信息

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗,利用甲基营养型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)系统表达戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)Ⅳ型结构区ORF2编码蛋白第112-607氨基酸片段。为实现目的基因在汉逊酵母中的高效表达,根据汉逊酵母偏爱密码子优化设计目的基因,用搭桥PCR法合成优化后的基因序列,并克隆到多拷贝表达载体上,转化汉逊酵母营养缺陷宿主菌ATCC26012(Ura3-),在选择培养基上培养,运用PCR法筛选得到携带外源基因的重组菌株,然后用含甲醇的培养基诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE、ELISA和Westernblot检测和鉴定。SDS-PAGE实验结果表明目的蛋白分子量约为56kD,表达量占菌体总蛋白的12%;ELISA检测结果表明表达产物为具有免疫反应性的HEVORF2蛋白,ELISA效价最高可达1∶2048,目的蛋白表达量随着基因拷贝数的增加呈升高的趋势;Westernblot鉴别实验结果证实表达产物与HEV多抗有特异性抗原抗体结合反应。HEV结构区ORF2蛋白在汉逊酵母中的成功表达,为研制基因工程戊型肝炎疫苗奠定了基础。

关键词：戊型肝炎病毒 ORF2基因汉逊酵母表达 56kD蛋白

甲型H1N1流感病毒HA63-286蛋白的原核表达及免疫原性初步研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2011年第10期31卷 926-926页

作者：曹磊顾美荣沈岩宋琳琳孟凡童戚治国马民强北京民海生物科技有限公司 102600

近年来，随着甲型HlNl流感的不断暴发，对新型流感疫苗的开发和安全应用越来越得到重视。对甲型H1N1的血凝素（HA）第63-286氨基酸区进行基因克隆，并将其插入到大肠杆菌表达载体pTXBl中进行表达，对其免疫原性进行了初步的研究，为开... 详细信息

近年来，随着甲型HlNl流感的不断暴发，对新型流感疫苗的开发和安全应用越来越得到重视。对甲型H1N1的血凝素（HA）第63-286氨基酸区进行基因克隆，并将其插入到大肠杆菌表达载体pTXBl中进行表达，对其免疫原性进行了初步的研究，为开展基因工程疫苗和核酸疫苗研究提供了资料。根据GenBank中甲型流感病毒[A／California／07／2009（H1N1）]血凝素基因的核甘酸序列（FJ969540），选取其中第63-286个氨基酸，设计1对特异性引物进行扩增。

关键词：甲型流感病毒免疫原性原核表达血凝素基因蛋白基因工程疫苗特异性引物氨基酸

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肠道病毒A组71型病毒参考品的建立及应用

中国病毒病杂志 2024年第2期14卷 159-165页

作者：谢学超陈磊赵丽丽徐颖之顾美荣张改梅北京民海生物科技有限公司北京市新型联合疫苗工程技术研究中心北京102600

目的建立肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EV-A71)灭活疫苗病毒参考品,用于病毒滴度内部质控品及灭活效果验证实验室评价。方法建立1批病毒参考品,按照《中华人民共和国药典》对其进行检定,包括无菌、支原体及分子生物学鉴定检查等。... 详细信息

目的建立肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EV-A71)灭活疫苗病毒参考品,用于病毒滴度内部质控品及灭活效果验证实验室评价。方法建立1批病毒参考品,按照《中华人民共和国药典》对其进行检定,包括无菌、支原体及分子生物学鉴定检查等。对其滴度进行标定和储存稳定性研究,并进行病毒滴定和灭活效果验证方面的应用研究。结果建立的EV-A71病毒参考品无菌检查及支原体检查结果均符合规定。分子生物学鉴定结果显示参考品只含有单一的EV-A71 VP1特异性条带。EV-A71病毒参考品标定后的滴度平均值为7.000 lgCCID_(50)/ml(95%CI为6.917~7.083 lgCCID_(50)/ml),可接受范围为6.566~7.434 lgCCID_(50)/ml,变异系数(coefficient of variation,CV)为3.01%,于-60℃及以下存放12个月的CV为2.08%,稳定性良好。将参考品作为病毒滴定测定的内部质控品应用于日常监测50次试验,滴度趋势分析结果显示未出现超趋势现象(out of trend,OOT)且均在警戒限内;将参考品作为阳性对照应用于灭活效果验证,结果显示细胞感染法及免疫荧光法的检测结果较为一致。结论建立了EV-A71病毒感染性滴度检测用参考品(EV-A71病毒参考品),12个月内储存稳定性良好,可用于EV-A71灭活疫苗生产工艺中病毒滴度评价和控制,以及作为灭活效果验证中的阳性对照,从而为单价或多价肠道病毒灭活疫苗的研究提供理论依据。

关键词：肠道病毒A组71型滴度参考品病毒滴定灭活效果验证

肠道病毒71型灭活疫苗(Vero细胞)抗原含量检测方法的建立及应用

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微生物学免疫学进展 2023年第6期51卷 21-28页

作者：赵丽丽谢学超陈磊李国顺顾美荣张改梅北京民海生物科技有限公司研发中心北京市新型联合疫苗工程技术研究中心北京102600

目的建立肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV-A71)灭活疫苗(Vero细胞)抗原含量检测方法并对其进行方法学验证及初步应用。方法以抗EV-A71兔多克隆抗体为包被抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的抗EV-A71鼠单克隆... 详细信息

目的建立肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV-A71)灭活疫苗(Vero细胞)抗原含量检测方法并对其进行方法学验证及初步应用。方法以抗EV-A71兔多克隆抗体为包被抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的抗EV-A71鼠单克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA并验证其线性范围、专属性、准确度、精密度及耐用性等。通过检测EV-A71疫苗原液及研发生产工艺各中间制品的EV-A71抗原含量评价该方法的适用性。结果包被抗体与酶标抗体最佳稀释度分别为1∶5000和1∶10000。抗原为5~80 U/mL时,线性良好;与同为肠道病毒的其他抗原不存在交叉反应,专属性良好;对不同浓度抗原进行6次测定,其回收率在90%~100%,准确度良好;不同实验员对不同浓度抗原样品检测3次,CV均<11%,精密度良好;针对不同影响因素设计耐用性试验,回收率均在80%~120%,耐用性良好。该方法检测EV-A71疫苗原液和制备过程中的中间制品均具有良好的线性和平行性,表明该方法具有良好的适用性。结论建立了EV-A71疫苗(Vero细胞)抗原含量检测方法并进行了初步应用,为EV-A71疫苗和HFMD多价疫苗的研发及质量控制提供了可靠的检测方法。

关键词：肠道病毒71型双抗体夹心酶联免疫法抗原含量单克隆抗体多克隆抗体

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RD细胞库的建立及其相关研究

中国病毒病杂志 2022年第4期12卷 277-283页

作者：谢学超赵丽丽陈磊曹慧佼顾美荣张改梅北京民海生物科技有限公司北京市新型联合疫苗工程技术研究中心北京102600

目的建立人恶性胚胎横纹肌瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞工作细胞库,并对RD细胞工作细胞库应用于肠道病毒灭活疫苗滴度的测定及中和抗体检测的可行性进行相关研究。方法建立工作细胞库,按照《中华人民共和国药典》对其进行检定,包... 详细信息

目的建立人恶性胚胎横纹肌瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞工作细胞库,并对RD细胞工作细胞库应用于肠道病毒灭活疫苗滴度的测定及中和抗体检测的可行性进行相关研究。方法建立工作细胞库,按照《中华人民共和国药典》对其进行检定,包括细胞活力、细胞形态、无菌检查、支原体及细胞外源病毒因子检查等,并对RD细胞生长曲线、传代稳定性及肠道病毒敏感性进行研究。结果实验建立的RD细胞工作细胞库呈梭形、大的多核上皮样细胞形态,有良好的生长状态,细胞活率为98.85%,无菌检查、支原体以及细胞外源病毒因子指标均符合规定。RD细胞生长曲线呈S型,细胞在3~6 d进入对数生长期,而后到达平台期,细胞倍增时间为27 h,连续传20代细胞形态正常。不同代次RD细胞检测肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71)、柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus 6,CVA6)、柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus 10,CVA10)、柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus 16,CVA16)肠道病毒的滴度均值分别为(8.20±0.07)、(7.84±0.12)、(7.93±0.09)、(7.34±0.16)lgCCID/ml,变异系数(coefficient of variation,CV)在0.88%~2.12%。结论建立的工作细胞库符合《中华人民共和国药典》规定,传代稳定性良好,RD细胞对肠道病毒较为敏感,可以用于肠道病毒疫苗相关病毒滴度的测定及疫苗中和抗体检测.

关键词：横纹肌肉瘤细胞细胞库传代稳定性病毒敏感性

测定重组肠道病毒71型疫苗(汉逊酵母)原液纯度的高效分子排阻色谱法的建立及方法的验证

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中国生物制品学杂志 2019年第2期32卷 207-210,214页

作者：张改梅陈磊李国顺肖海峰李进郭林刘思航徐颖之朱芮波刘建凯顾美荣北京民海生物科技有限公司研发中心北京102600 深圳康泰生物制品股份有限公司研发中心广东深圳518000

目的建立检测重组肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)(汉逊酵母)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)纯度的高效分子排阻色谱法(SEC-HPLC),并进行验证。方法建立SEC-HPLC法检测EV71 VLP纯度,并对该方法的专属性、精密度、检测限、定量... 详细信息

目的建立检测重组肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)(汉逊酵母)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)纯度的高效分子排阻色谱法(SEC-HPLC),并进行验证。方法建立SEC-HPLC法检测EV71 VLP纯度,并对该方法的专属性、精密度、检测限、定量限、耐用性及拖尾因子等指标进行验证。结果空白溶剂在设定的积分范围内无特异峰出现。重复性试验中原液参比品保留时间和峰面积相对标准偏差(RSD)分别为0. 14%和0. 21%,3批分析原液保留时间RSD均<0. 3%,峰面积RSD均<0. 8%;中间精密度试验原液参比品和3批分析原液保留时间RSD均<0. 2%;峰面积RSD均<2. 0%。检测限为样品浓度2. 5μg/mL,进样体积20μL;定量限为样品浓度10μg/mL,进样体积20μL。耐用性试验中原液参比品在不同浓度流动相中连续进样3次,保留时间和峰面积RSD均<2. 0%。原液参比品和3批分析原液目的峰的拖尾因子为1. 210±0. 01,RSD为0. 90%。结论建立的SEC-HPLC方法专属性、精密度、耐用性良好,适用于EV71(汉逊酵母)VLP纯度的检测。

关键词：高效分子排阻色谱法重组肠道病毒71型疫苗(汉逊酵母) 病毒样颗粒纯度

柯萨奇病毒A组6型通用抗原检测试剂盒的建立

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中国生物制品学杂志 2021年第3期34卷 300-306页

作者：刘思远卞莲莲高帆刘佩霍雅倩王泽鋆张中洋李雅静戈小琴顾美荣安超强李克雷毛群颖姜崴中国食品药品检定研究院北京102600 长春生物制品研究所有限责任公司吉林长春130000 武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430207 国药中生生物技术研究院有限公司北京101111 北京科兴生物制品有限公司北京100085 北京民海生物科技有限公司北京102600

目的建立柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)疫苗抗原定量检测试剂盒,用于CV-A6疫苗以及含有CV-A6的手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)多价疫苗的研发及质量控制。方法分别采用多个CV-A6毒株与多家企业的CV-A6抗原,... 详细信息

目的建立柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)疫苗抗原定量检测试剂盒,用于CV-A6疫苗以及含有CV-A6的手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)多价疫苗的研发及质量控制。方法分别采用多个CV-A6毒株与多家企业的CV-A6抗原,通过结合能力和中和能力比较,从6个单克隆抗体(9H1、3D9、10F4、5A6、6D12和10G8)中筛选出具有广谱高结合能力及高中和能力的单克隆抗体,建立ELISA法CV-A6抗原定量检测试剂盒。对试剂盒进行线性、专属性、准确度、精密度、耐用性等验证。将试剂盒分发国内主要CV-A6疫苗研发企业,由各企业分别采用该试剂盒对各自制备的CV-A6疫苗原液以及生产工艺各中间环节制品进行CV-A6抗原含量检测,考核试剂盒适用性。结果以多克隆抗体CV-A6-3I作为包被抗体,最佳浓度为1∶8 000,以5A6单克隆抗体作为酶标抗体,最佳浓度为1∶8 000;包被条件为4℃过夜;封闭液为10%FBS+PBST+5%蔗糖,37℃封闭2 h;抗体稀释液为ED-33,酶标抗体作用条件为37℃1 h;显色条件为37℃10 min。建立的CV-A6抗原检测试剂盒线性范围为11~178 ng/mL,线性良好,定量检出限为11 ng/mL;与同为小RNA病毒科的CV-A16、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)、CV-A10、EV-A71以及MEM、DMEM和PBS缓冲液等均无交叉反应,专属性良好;检测回收率在83%~114%之间,单个实验员和2个实验员重复检测CV均小于15%,准确度、重复性和中间精密度均良好;抗原或酶标抗体孵育时间上下浮动5 min或反应温度上下浮动2℃,回收率在83%~107%之间,耐用性良好。该试剂盒检测4个企业制备的CV-A6疫苗原液和疫苗制备过程中的中间制品均具有良好的线性和平行性,提示该试剂盒对国内主要CVA6疫苗及中间制品均具有良好的适用性。结论本研究采用具有高效价、广谱中和活性的单克隆抗体和多克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA法CV-A6疫苗抗原定量检测试剂盒。经方法验证和适用性研究,证明该试剂盒各项指标良好,可作为CV-A6疫苗通用试剂盒用于CV-A6抗原含量检测,为CV-A6疫苗和HFMD多价疫苗研发及质量控制提供了可靠的检测手段。

关键词：柯萨奇病毒A组6型抗原试剂盒酶联免疫法中和试验