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非洲猪瘟病毒抗体化学发光检测方法的建立与应用

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中国畜牧兽医 2024年第4期51卷 1362-1371页

作者：向国庆孙菁晗宋帅温肖会吕殿红贾春玲牛瑞辉顾有方罗胜军安徽科技学院动物科学学院动物营养调控与健康安徽省重点实验室凤阳233100 广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640

【目的】建立一种特异性强、敏感度高、操作简捷、高通量的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体化学发光检测方法,用于早期监测ASFV的流行情况。【方法】本研究以羧基磁珠作为固相载体偶联ASFV重组p72蛋白,用适量的牛血清白蛋白... 详细信息

【目的】建立一种特异性强、敏感度高、操作简捷、高通量的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体化学发光检测方法,用于早期监测ASFV的流行情况。【方法】本研究以羧基磁珠作为固相载体偶联ASFV重组p72蛋白,用适量的牛血清白蛋白(BSA)进行封闭,加入检测样品进行反应,以兔抗猪IgG-AP抗体作为酶标抗体,加入相应底物进行显色,优化各项反应条件,建立ASFV抗体化学发光检测方法,并对该方法的特异性、敏感度、重复性和检出率进行验证。【结果】建立的ASFV抗体化学发光检测方法蛋白与羧基磁珠偶联最适pH为7.0,最佳蛋白偶联浓度为5μg/mL,使用10%BSA溶液封闭效果最佳,反应磁珠终浓度为1.00 mg/mL,酶标二抗最佳工作稀释度为1∶40000。同时该方法反应时间为30 min,血清稀释度为1∶512,敏感度高于商品化ASFV抗体ELISA检测试剂盒,与猪瘟病毒、A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒gE、猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性标准血清均无交叉反应。重复性试验中,批内变异系数为4.41%~8.70%,批间变异系数为2.43%~8.07%,均<10%。通过检测120份血清样品并与商业化ASFV抗体ELISA检测试剂盒进行对比分析,商业化ELISA试剂盒检出率为96.7%,本研究建立的化学发光检测方法检出率为100%。【结论】本研究建立的ASFV抗体化学发光检测方法可用于ASFV感染后抗体水平检测,为后续试剂盒的开发提供参考。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) 重组p72蛋白化学发光抗体

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羊巴贝斯虫病流行病学的研究进展

中国动物传染病学报 2024年第3期 221-226页

作者：顾月月薄震宇刘欣超郑克雷李惠虹周金星靳二辉李文超胡忠泽顾有方动物营养调控与健康安徽省重点实验室安徽科技学院动物科学学院

羊巴贝斯虫病是一种由硬蜱传播的血液原虫病，呈全球性分布，主要临床症状为发热、四肢无力、贫血、腹泻、反刍减弱、厌食、精神不振、虚弱等，严重可导致死亡。本文阐述了巴贝斯虫病病原的种类，并对感染羊的莫氏巴贝斯虫、绵羊巴贝斯... 详细信息

羊巴贝斯虫病是一种由硬蜱传播的血液原虫病，呈全球性分布，主要临床症状为发热、四肢无力、贫血、腹泻、反刍减弱、厌食、精神不振、虚弱等，严重可导致死亡。本文阐述了巴贝斯虫病病原的种类，并对感染羊的莫氏巴贝斯虫、绵羊巴贝斯虫、粗糙巴贝斯虫、泰氏巴贝斯虫和叶状巴贝斯虫的流行病学情况进行了总结，为羊巴贝斯虫病的防控提供一定的依据。

关键词：巴贝斯虫病绵羊巴贝斯虫莫氏巴贝斯虫粗糙巴贝斯虫泰氏巴贝斯虫叶状巴贝斯虫

基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立

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安徽科技学院学报 2024年第3期38卷 25-33页

作者：胡帅琪丛潇练月晓伍妙梨朱于军丛锋顾有方闻爱友安徽科技学院动物科学学院安徽凤阳233100 动物营养调控与健康安徽省重点实验室安徽凤阳233100 广东省实验动物监测所广东省实验动物重点研究室广东广州510633

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此... 详细信息

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。

关键词：猪德尔塔冠状病毒重组核衣壳蛋白间接ELISA 诊断方法

血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表达及多克隆抗体制备

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安徽科技学院学报 2024年第2期38卷 25-30页

作者：罗昕雨赵磊陈玉晴缪欣怡石家鑫顾有方李文超刘欣超安徽科技学院动物科学学院安徽凤阳233100 动物营养调控与健康安徽省重点实验室安徽凤阳233100

目的:制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1基因截短蛋白多克隆抗体,为FAdV-4病的诊断、检测及致病机制研究奠定基础。方法:对FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株Fiber-1基因序列(MG148335.1:30459-31754)进行信号肽、疏水性和抗原决定簇分析,... 详细信息

目的:制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1基因截短蛋白多克隆抗体,为FAdV-4病的诊断、检测及致病机制研究奠定基础。方法:对FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株Fiber-1基因序列(MG148335.1:30459-31754)进行信号肽、疏水性和抗原决定簇分析,截取具有较高免疫原性的片段,设计合成特异性引物,以CH/AHMC/2015分离株基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得截短Fiber-1(sFiber-1)基因片段,将其连接至原核表达载体pET-32a,验证后转化至大肠杆菌BL21感受态中,诱导表达sFiber-1蛋白。纯化后的蛋白与佐剂乳化后免疫SD大鼠,制备多克隆抗体,并测定多克隆抗体效价。用Western-blot检测抗体免疫原性。结果:成功构建了sFiber-1的原核表达载体,获得FAdV-4的sFiber-1重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定,重组sFiber-1蛋白大小约为52 kDa,主要以包涵体形式表达;间接ELISA法测得sFiber-1多克隆抗体效价为1∶2^(13);Western blot结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别出重组sFiber-1蛋白。结论:本研究成功表达了FAdV-4的重组sFiber-1蛋白,制备了具有较高免疫活性的sFiber-1多克隆抗体,可为FAdV-4的检测及诊断奠定基础。

关键词：血清4型禽腺病毒 Fiber-1基因重组蛋白多克隆抗体

G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其在鸡坏死性肠炎发病模型中的应用

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安徽科技学院学报 2024年第2期38卷 31-38页

作者：孙栋宋忠锋倪君丽方肆云王定爱申翰钦严专强戚南山孙铭飞顾有方安徽科技学院动物科学学院动物营养调控与健康安徽省重点实验室安徽凤阳233100 广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室广东广州510640 温氏食品集团股份有限公司广东新兴527400

目的:探讨不同诱导因素对鸡坏死性肠炎(Necrotic enteritis,NE)的诱发效果,以便建立鸡坏死性肠炎的发病模型。方法:以安徽省某规模化鸡场采集的病鸡肠道样品中分离出的G型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)(CPG-AH5... 详细信息

目的:探讨不同诱导因素对鸡坏死性肠炎(Necrotic enteritis,NE)的诱发效果,以便建立鸡坏死性肠炎的发病模型。方法:以安徽省某规模化鸡场采集的病鸡肠道样品中分离出的G型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)(CPG-AH5株)为病原菌,分析单独或联合感染毒害艾美耳球虫对在饲喂高蛋白饲料(添加鱼粉)和不饲喂高蛋白饲料条件下,诱发鸡坏死性肠炎的影响。结果:无诱导因素时,1.1×10^(9)CFU/mL剂量下CPG-AH5株感染可造成肠道损伤(平均病变评分为1.5±0.85分);单一诱导因素(鱼粉或球虫)不能有效促进CPG-AH5株的感染,肠道病变与无诱导因素条件下无显著性提高(2.0±1.15、2.4±1.08,P>0.05);多个诱导因素(鱼粉和球虫)联合诱导可有效促进CPG-AH5株的感染,与无诱导因素和单一诱导因素相比肠道病变显著性提高(3.6±0.52,P<0.001)。结论:鱼粉和球虫联合诱导可显著促进G型产气荚膜梭菌的感染,提高肠道病变。本研究建立了一种鸡坏死性肠炎发病模型,有利于对鸡坏死性肠炎发病机制的研究,为疫苗及药物的后续研发和筛选评价提供了新的技术支撑。

关键词：坏死性肠炎 G型产气荚膜梭菌毒害艾美耳球虫发病模型

猴头菇多糖对免疫应激小鼠胸腺和脾脏显微结构、免疫功能及细胞增殖和凋亡的影响

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中国食品卫生杂志 2022年第3期34卷 482-490页

作者：王趁芳邓娟韩玉皎顾有方靳二辉金光明安徽科技学院生命与健康科学学院安徽滁州233100 动物营养调控与健康安徽省重点实验室安徽滁州233100

目的研究猴头菇多糖对脂多糖(LPS)诱导免疫应激小鼠胸腺和脾脏显微结构、细胞因子分泌、抗氧化功能及细胞增殖和凋亡的影响,为猴头菇多糖在缓解应激状态中的应用提供参考。方法选用12周龄雄性昆明小鼠50只,随机分为对照组、模型组和试验... 详细信息

目的研究猴头菇多糖对脂多糖(LPS)诱导免疫应激小鼠胸腺和脾脏显微结构、细胞因子分泌、抗氧化功能及细胞增殖和凋亡的影响,为猴头菇多糖在缓解应激状态中的应用提供参考。方法选用12周龄雄性昆明小鼠50只,随机分为对照组、模型组和试验Ⅰ-Ⅲ组(n=10)。除对照组腹腔注射生理盐水外,其余4组在试验结束前3 d腹腔注射0.6 mL/kg/d的LPS(1次/d)。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别灌胃80、160、320 mg/kg的猴头菇多糖,持续2周。测定胸腺和脾脏促炎细胞因子水平、抗氧化功能及细胞增殖和凋亡基因表达,并进行显微结构观察分析。结果与对照组相比,模型组胸腺和脾脏中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),总超氧化物歧化酶(T-SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)活性显著降低(P<0.05)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量也显著降低(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05),脾脏增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA表达量显著降低(P<0.05),半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达量显著增加(P<0.05)。与模型组相比,试验Ⅲ组小鼠胸腺和脾脏IL-1β、IL-4和IFN-γ水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),T-SOD、T-AOC和GSH-Px的活性或含量均显著升高(P<0.05)、MDA含量和Caspase-3 mRNA表达量显著降低(P<0.05)。组织学观测发现,试验Ⅲ组小鼠胸腺和脾脏显微结构与模型组相比明显改善,胸腺皮质厚度增加(P<0.01),脾小结和动脉周围淋巴鞘厚度降低(P<0.05或P<0.01)。结论补充320 mg/kg猴头菇多糖能够明显改善免疫应激对小鼠胸腺和脾脏显微结构的损伤,抑制免疫应激诱导的促炎细胞因子分泌和细胞凋亡基因表达,增强抗氧化酶活性。

关键词：猴头菇多糖免疫器官显微结构免疫功能抗氧化功能细胞增殖和凋亡

微量元素硼对大鼠回肠显微结构、消化酶活性、屏障功能及抗氧化功能的影响

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食品科学 2022年第13期43卷 80-88页

作者：韩玉皎邓娟赵春芳胡倩倩任曼顾有方靳二辉李升和安徽科技学院动物科学学院安徽凤阳233100 动物营养调控与健康安徽省重点实验室安徽凤阳233100

本实验旨在研究饮水中添加不同剂量硼元素对大鼠回肠显微结构、消化酶活性、屏障功能及抗氧化功能的影响。选用100只刚断乳的清洁级SD大鼠,适应性饲养1周后随机分成10组(n=10),对照组饮用蒸馏水,实验I~IX组分别饮用含5、10、20、40、80... 详细信息

本实验旨在研究饮水中添加不同剂量硼元素对大鼠回肠显微结构、消化酶活性、屏障功能及抗氧化功能的影响。选用100只刚断乳的清洁级SD大鼠,适应性饲养1周后随机分成10组(n=10),对照组饮用蒸馏水,实验I~IX组分别饮用含5、10、20、40、80、160、320、480 mg/L和640 mg/L硼的蒸馏水,实验期60 d。结果表明,与对照组相比,饮水中添加5 mg/L硼的大鼠回肠绒毛高度和杯状细胞(goblet cell,GC)数量极显著增加(P<0.01),紧密连接蛋白ZO-1(P<0.05)和Occludin(P<0.01)表达量显著升高,麦芽糖酶(P<0.05)、乳糖酶(P<0.01)、α-淀粉酶(P<0.01)、脂肪酶(P<0.01)活力以及总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)(P<0.05)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力(P<0.01)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)含量(P<0.01)显著增加。饮水添加10 mg/L硼的大鼠回肠GC(P<0.05)和上皮内淋巴细胞(intra-epithelial lymphocytes,IEL)(P<0.01)数量显著增加,分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIg A)(P<0.05)、ZO-1(P<0.01)和Occludin(P<0.01)表达量显著升高,乳糖酶(P<0.01)、SOD(P<0.01)活力和GSH-Px含量(P<0.05)也显著增加。而饮水添加480 mg/L和640 mg/L硼的大鼠GC(P<0.01)和IEL(P<0.01)数量显著降低,SIg A(P<0.01)、ZO-1(P<0.05)和Occludin(P<0.01)表达量均显著降低,麦芽糖酶活力以及T-AOC也显著降低(P<0.05)。结论:饮水补充5 mg/L和10 mg/L硼可改善大鼠回肠的显微结构,增强消化酶活性、屏障功能以及抗氧化功能,而饮水补充480 mg/L和640 mg/L硼则产生相反作用。

关键词：硼回肠显微结构消化酶活性屏障功能抗氧化功能

硼对大鼠肝脏显微结构、肝糖原含量、抗氧化功能及细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响

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动物营养学报 2022年第3期34卷 1963-1974页

作者：丁永旺任曼赵春芳顾有方靳二辉李升和安徽科技学院动物科学学院凤阳233100 动物营养调控与健康安徽省重点实验室凤阳233100

本试验旨在研究硼对大鼠肝脏显微结构、肝糖原含量、抗氧化功能及细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响。选用100只清洁级健康的(22±2)日龄雄性SD大鼠,适应性7 d后随机分为10组,每组10只。对照组饮用蒸馏水(硼含量为0),试验组分别饮用硼... 详细信息

本试验旨在研究硼对大鼠肝脏显微结构、肝糖原含量、抗氧化功能及细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响。选用100只清洁级健康的(22±2)日龄雄性SD大鼠,适应性7 d后随机分为10组,每组10只。对照组饮用蒸馏水(硼含量为0),试验组分别饮用硼含量为5、10、20、40、80、160、320、480、640 mg/L的蒸馏水。试验期60 d。结果表明:1)与对照组相比,饮水补充5、10和20 mg/L硼可明显改善肝脏显微结构,肝小叶轮廓更加清晰,肝细胞索排列更加整齐,双核肝细胞数量增多,肝枯否氏细胞数量增加,进而改善肝脏显微结构;而饮水补充480和640 mg/L硼则导致肝细胞索排列紊乱,肝血窦变宽,肝细胞核染色加深,肝细胞内出现空泡样结构。2)与对照组相比,饮水补充5和10 mg/L硼极显著提高肝脏中肝糖原含量(P<0.01),显著或极显著提高肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)(P<0.05或P<0.01),显著或极显著提高肝脏核因子E2相关因子2(Nrf2)和增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA相对表达量(P<0.05或P<0.01);饮水补充480和640 mg/L硼则极显著降低肝脏中肝糖原含量(P<0.01),显著或极显著降低肝脏T-AOC(P<0.05或P<0.01),显著或极显著提高肝脏丙二醛(MDA)含量(P<0.05或P<0.01),极显著提高肝脏B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)和半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA相对表达量(P<0.01),显著或极显著降低肝脏Nrf2、依赖还原型辅酶Ⅰ(Ⅱ)醌氧化还原酶1(NQO1)、PCNA和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)mRNA相对表达量(P<0.05或P<0.01)。由此可见,饮水补充5和10 mg/L硼可明显改善大鼠肝脏显微结构,增加肝糖原含量,提高肝脏抗氧化能力,促进肝脏Nrf2和PCNA mRNA表达,而饮水补充480和640 mg/L硼则产生相反作用。

关键词：硼大鼠肝脏显微结构抗氧化功能细胞增殖和凋亡

实验感染肝片吸虫山羊的病理生理学 Ⅱ.血清NO和花生四烯酸代谢物的变化

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中国兽医学报 2004年第2期24卷 168-170页

作者：顾有方安徽技术师范学院安徽凤阳233100

选择 9只 6～ 10月龄健康雄性白山羊 ,经粪便检查和 Dot- EL ISA检测 ,确认无肝片吸虫感染 ,随机分成感染组(n=5 )和对照组 (n=4 ) ,试验组每只一次性口服接种 15 0个肝片吸虫囊蚴 ,感染前 (0周 )至感染后 2 3周每周从颈静脉采集血液 1... 详细信息

选择 9只 6～ 10月龄健康雄性白山羊 ,经粪便检查和 Dot- EL ISA检测 ,确认无肝片吸虫感染 ,随机分成感染组(n=5 )和对照组 (n=4 ) ,试验组每只一次性口服接种 15 0个肝片吸虫囊蚴 ,感染前 (0周 )至感染后 2 3周每周从颈静脉采集血液 1次 ,分离血清 ,测定一氧化氮含量和花生四烯酸代谢物 6 -酮 -前列腺素 F1α(6 - keto- PGF1α)和血栓素 B2(TXB2 )的变化。结果表明 ,肝片吸虫感染后第 6～ 2 1周试验组血清中的 NO一直高于对照组 ,并在第 7、10周时显著地高于对照组 ;血浆中 TXB2 水平变化较为明显 ,在 1～ 3周与对照组相比无显著差异 ,从第 5周开始到试验结束 ,试验组血浆中 TXB2 水平均显著或极显著地高于对照组 ;在整个试验期间 ,血浆中 6 - keto- PGF1α水平变化不显著。这一结果提示 ,NO及花生四烯酸代谢物可能参与山羊肝片吸虫病的发生发展过程。

关键词：感染肝片吸虫山羊一氧化氮花生四烯酸