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真菌来源溶菌酶在黑曲霉中的高效表达研究

真菌来源溶菌酶在黑曲霉中的高效表达研究

作者：顾力行华南理工大学

学位级别：硕士

溶菌酶(EC 3.***.1.17)又称胞壁质酶,能够水解肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4糖苷键,细菌失去细胞壁的支撑而裂解死亡。溶菌酶不仅是一种天然的、安全的且性能优秀的杀菌剂,也是身体内一种重要的非特异性免疫因子,被广泛... 详细信息

溶菌酶(EC 3.***.1.17)又称胞壁质酶,能够水解肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4糖苷键,细菌失去细胞壁的支撑而裂解死亡。溶菌酶不仅是一种天然的、安全的且性能优秀的杀菌剂,也是身体内一种重要的非特异性免疫因子,被广泛应用于食品工业、生物医药、饲料制造等领域。真菌的生长环境复杂,体内溶菌酶或具有耐碱、耐高温等市售鸡蛋清溶菌酶不具备的优点。目前对于溶菌酶的研究主要集中于鸡蛋清溶菌酶和人源溶菌酶,有关真菌溶菌酶的研究报道甚少,产量也相对较低。本课题组构建的低背景无孢黑曲霉HL-1表达宿主在淀粉发酵培养基中死亡过早,导致目的蛋白产量大幅降低,推测是构建表达宿主时淀粉水解酶类的相关基因敲除使宿主无法利用发酵培养基中的碳源而死亡。本论文研究首先在表达宿主中回补淀粉水解酶类基因如糖化酶基因促进宿主在发酵培养基中正常生长。针对真菌溶菌酶的表达研究,我们分析选择了3个有应用潜力的真菌来源的溶菌酶基因在黑曲霉宿主中表达筛选,获得高活性的溶菌酶基因Ly Aa,进一步联合使用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具的策略提高溶菌酶产量,发酵液经过镍柱亲和层析纯化后,分析研究了溶菌酶的酶学性质。主要研究内容如下:(1)糖化酶启动子Tgla A以及糖化酶gla A基因和线性化通用载体连接成表达载体,转化宿主黑曲霉HL-1,成功表达糖化酶。在发酵培养基中,原始宿主无法有效利用淀粉碳源,在发酵至第3天菌体已经开始断裂死亡,。而宿主经过改造优化后,在发酵至第6天仍拥有较高的菌体量,且菌丝生长状态正常,达到工业稳定发酵的条件。(2)杂合启动子Pna II和3种溶菌酶分别与线性化通用载体UEV连接,构建3个不同溶菌酶的表达载体,转化经过优化的黑曲霉HL-1宿主后表达筛选,其中来源于嗜碱顶孢霉Acremonium alcalophilum的GH25酶系的溶菌酶Ly Aa的表达酶活最高,其转化子Ly Aa-T发酵上清液最高酶活力为358.41 U/m L。(3)在已有溶菌酶Ly Aa单拷贝表达载体上,增加另一个由杂合启动子Pna II、溶菌酶Ly Aa基因和糖化酶Pgla A终止子组成的表达框插入,与原拷贝反向连接,获得双拷贝溶菌酶Ly Aa表达载体。并应用CRISPR/Cas9工具共转,分别得到双拷贝转化菌株Ly Aa-F和四拷贝转化菌株Ly Aa-C。Ly Aa-C(四拷贝)发酵上清液的最高酶活力达到2291.37 U/m L,是Ly Aa-F(双拷贝,869.74 U/m L)的2.63倍,是Ly Aa-T(单拷贝,358.41 U/m L)的6.39倍,SDS-PAGE结果显示Ly Aa-C发酵上清液的目的蛋白(25.0k Da)浓度最高。使用镍柱亲和层析纯化溶菌酶Ly Aa,酶学性质研究表明最适温度为30℃,70℃以下有良好的热稳定性;最适p H值为4.0,p H为3.5～5.0时性质稳定;与鸡蛋清溶菌酶相比,拥有良好的胃蛋白酶稳定性,具有很好的应用潜力。

关键词：溶菌酶黑曲霉高效表达 CRISPR/Cas9工具

溶菌酶LyAa在黑曲霉中的高效表达与酶学性质分析

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现代食品科技 2023年第1期39卷 41-49页

作者：顾力行王斌潘力华南理工大学生物科学与工程学院广东省发酵与酶工程重点实验室广东广州510006

该研究探讨了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后,构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达,利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具,使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,... 详细信息

该研究探讨了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后,构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达,利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具,使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,获得高酶活力的溶菌酶表达菌株。重组菌株LyAa-C的溶菌酶活力达到2291.37 U/mL,是仅使用双拷贝表达载体的LyAa-F菌株酶活力(869.74 U/mL)的2.63倍,是仅使用传统单拷贝表达载体的LyAa-T菌株酶活力(358.41 U/mL)的6.39倍。通过6×His标签使用镍柱亲和层析成功纯化了重组溶菌酶LyAa,并对其酶学性质进行了分析。溶菌酶LyAa蛋白大小约为25.0 ku,最适pH值为4.0,最适温度为30℃,并显示出良好的胃蛋白酶稳定性。综上,该研究基于双拷贝载体和CRISPR技术成功优化和提高了溶菌酶在黑曲霉中的表达。

关键词：溶菌酶黑曲霉高效表达酶学性质

不同信号肽对嵌合抗原受体T细胞杀伤作用的影响研究

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中国癌症杂志 2022年第2期32卷 142-151页

作者：李帆张琴星童祥文田高辉顾力行徐瑶武汉科技大学生命科学与健康学院生物医学研究院湖北武汉430081

背景与目的:信号肽(signal peptide,SP)是一段存在于前体蛋白N-端的短肽链,能够调节前体蛋白的折叠和转移,在蛋白质的分泌过程中扮演着极其重要的角色。近年来,靶向CD19的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞在白血病治... 详细信息

背景与目的:信号肽(signal peptide,SP)是一段存在于前体蛋白N-端的短肽链,能够调节前体蛋白的折叠和转移,在蛋白质的分泌过程中扮演着极其重要的角色。近年来,靶向CD19的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞在白血病治疗中取得了重大突破,关于CAR结构的胞内域改造方面也有诸多研究,而对单链可变片段(scFv)的N端SP研究进展缓慢。探讨4种不同SP的CD19-CAR在T细胞表面表达及对CD19+靶细胞的杀伤作用。方法:通过基因合成和分子克隆技术,构建含4种不同SP(SP1、SP2、SP3、SP4)的靶向CD19抗原的CAR载体,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染T细胞,利用流式细胞术检测细胞转染效率,采用钙黄绿素释放法检测该细胞对靶细胞的杀伤作用,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌水平。结果:成功构建4种不同SP的重组慢病毒载体,将4种慢病毒转导T细胞后,结果显示,分别有20.9%、22.6%、31.5%、38.6%的T细胞表面能够表达CD19-CAR(分别命名为SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19和SP4-CD19细胞),进一步杀瘤实验证明,SP4-CD19细胞对CD19+肿瘤细胞的杀伤作用显著高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19细胞(P0.05)。结论:SP4-CD19细胞的转染效率、细胞因子分泌水平及对CD19+肿瘤细胞的杀伤作用均显著高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19细胞,该研究成果为CAR-T优化改造及其高效的临床应用奠定了科学基础。

关键词：信号肽嵌合抗原受体靶向CD19的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞体外杀瘤细胞因子

“真实与想象”的家园:《桑青与桃红》和《茉莉》的第三空间

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求索 2015年第3期 125-129页

作者：沈维维顾力行上海外国语大学浙江医学高等专科学校

著名华裔作家聂华苓的《桑青与桃红》和印裔作家巴拉迪·穆克吉的《茉莉》中的女性离散叙述和寻找家园经历如此相似和凝重,让人不得不重新审视这两部小说的寓意和离散女性的生存困境。两位边缘女性在流放旅途中不断变换自我,以适应周遭... 详细信息

著名华裔作家聂华苓的《桑青与桃红》和印裔作家巴拉迪·穆克吉的《茉莉》中的女性离散叙述和寻找家园经历如此相似和凝重,让人不得不重新审视这两部小说的寓意和离散女性的生存困境。两位边缘女性在流放旅途中不断变换自我,以适应周遭环境,并寻找她们的新家园。在"真实与想象"之间的第三空间为她们提供了第三种选择。第三空间是一个融合点,杂糅之地,是边缘群体在逃离旧的家园建立新关系的开放空间。小说中的离散女性在流放中的错位记忆,杂糅身份选择以及孕育新生命等行为,都是她们在第三空间重建自己家园的策略。

关键词：《桑青与桃红》《茉莉》第三空间家园离散女性

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当今跨文化交际研究中的文化悖论

中国外语 2014年第3期11卷 85-90页

作者：翁立平顾力行上海外国语大学

经济全球化带来了文化的变迁和融合,对学界现有文化观进行反思已成为必要。以"文化等同于国家"和"文化对个体行为具有决定性影响"为主要特征的固定特质观在当今跨文化交际学领域根深蒂固,可谓是一个文化悖论。为了使跨文化交际研究更加... 详细信息

经济全球化带来了文化的变迁和融合,对学界现有文化观进行反思已成为必要。以"文化等同于国家"和"文化对个体行为具有决定性影响"为主要特征的固定特质观在当今跨文化交际学领域根深蒂固,可谓是一个文化悖论。为了使跨文化交际研究更加契合当今的经济全球化趋势,本文对固定特质观进行系统的批判和分析,揭示其历史渊源、本质特征、内在缺陷和功能范围,并提出在跨文化交际研究中融入动态过程观的主张,试图实现对文化悖论的超越。

关键词：跨文化交际文化固定特质观动态过程观

活体生物发光肺癌骨转移模型构建及其生物学特性

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华中师范大学学报（自然科学版） 2023年第4期57卷 554-560页

作者：田禹杨文杨程刘雁萍王仲怡张小兰顾力行周俊周经姣武汉科技大学生命科学与健康学院武汉430065

在全世界范围内,肺癌一直是恶性肿瘤死亡的主要原因之一.肺癌容易复发和转移,其中骨转移是其常见的转移方式.将稳转Luciferase和GFP编码基因的A549细胞接种入胫骨内,第7天生物发光成像检测到胫骨腔内明显肿瘤生长信号.随着时间延长小鼠... 详细信息

在全世界范围内,肺癌一直是恶性肿瘤死亡的主要原因之一.肺癌容易复发和转移,其中骨转移是其常见的转移方式.将稳转Luciferase和GFP编码基因的A549细胞接种入胫骨内,第7天生物发光成像检测到胫骨腔内明显肿瘤生长信号.随着时间延长小鼠呈现明显的类似晚期癌症患者的恶液质现象,并伴随持续性疼痛和触觉疼痛.HE染色显示骨髓腔及骨小梁间被大量肿瘤细胞填充,骨髓腔和骨质结构破坏严重.骨肿瘤组织中肿瘤转移相关基因Mta1、Mta3高表达.上述结果表明,构建的骨转移模型具有人体肺癌骨转移相似的生物学特性及病理学表现,可用于开展肺癌骨转移相关机制研究、筛选开发抗肿瘤药物.此肺癌骨转移模型可以多时间点、动态地观测活体肿瘤病灶的生长情况,具有极高的检测灵敏度和非常高的医学应用价值.

关键词：肺腺癌骨转移模型荧光素酶和GFP双标记生物发光成像病理分析骨癌疼痛

外语教学与跨文化交际能力培养:模型建构二十年

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中国外语教育 2015年第3期8卷 11-19 107,107页

作者：付小秋顾力行上海外国语大学海南师范大学

国内跨文化交际能力建构的研究始于1994年,至今已有20个年头。在此期间,共有20个公开发表的文献建构了跨文化交际能力模型。笔者对建构这些模型的目的、方法和主要理论来源以及模型的构成进行了分析,得出以下结论:第一,我国跨文化交际... 详细信息

国内跨文化交际能力建构的研究始于1994年,至今已有20个年头。在此期间,共有20个公开发表的文献建构了跨文化交际能力模型。笔者对建构这些模型的目的、方法和主要理论来源以及模型的构成进行了分析,得出以下结论:第一,我国跨文化交际能力模型建构具有跨学科性和多样性;第二,现有模型有助于我们多层次地研究跨文化交际能力,也有助于我们在外语教学中对跨文化交际能力培养进行定位;第三,现有模型结构的单一性源于相对狭窄的理论来源和薄弱的实证、实践基础。

关键词：跨文化交际能力模型建构外语教学

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语言杂糅与文化杂糅:跨文化交际研究新视角

语言学研究 2016年第2期 119-130页

作者：翁立平顾力行上海外国语大学

语言和文化在全球范围内流动,使得语言文化杂糅成为常态,文化身份呈多元化趋势。以先验性文化差异为前设的跨文化交际研究,有必要借助杂糅这一理论建构来拓展研究思路,使研究更加贴近现实。本文尝试从语言、文化和认同三个方面,介绍杂... 详细信息

语言和文化在全球范围内流动,使得语言文化杂糅成为常态,文化身份呈多元化趋势。以先验性文化差异为前设的跨文化交际研究,有必要借助杂糅这一理论建构来拓展研究思路,使研究更加贴近现实。本文尝试从语言、文化和认同三个方面,介绍杂糅这一概念的基本含义及相关学术话语,指出杂糅这一概念对跨文化交际研究带来的挑战,并介绍学界针对上述挑战做出的回应。笔者希望通过上述讨论,为今后有关杂糅与跨文化交际的研究做一些理论铺垫。

关键词：杂糅语言文化文化认同跨文化交际

我国30年跨文化交际/传播教材的分析性评估(1985—2014)

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外语界 2015年第3期 89-96页

作者：索格飞翁立平顾力行上海外国语大学跨文化研究中心上海200083

本文采用内容分析法对1985至2014年30年间我国出版的122部跨文化交际/传播教材进行梳理和归类,系统考察教材的主题内容、性质和价值定位。研究结果表明:(1)国内跨文化研究广度不断拓展,多学科性日益凸显;(2)跨文化理论研究不足,研究方... 详细信息

本文采用内容分析法对1985至2014年30年间我国出版的122部跨文化交际/传播教材进行梳理和归类,系统考察教材的主题内容、性质和价值定位。研究结果表明:(1)国内跨文化研究广度不断拓展,多学科性日益凸显;(2)跨文化理论研究不足,研究方法有待改进;(3)理论与实践结合应成为未来跨文化交际/传播教学与研究的重点。

关键词：跨文化交际/传播教材分析性评估内容分析法