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嗜热脂肪酶的性质及其高效表达的研究

嗜热脂肪酶的性质及其高效表达的研究

作者：韩四平吉林大学

学位级别：硕士

脂肪酶全称为三酰基甘油水解酶，能够催化酯水解和酯合成，属于水解酶中最重要的一类，广泛应用于工业、农业、医药等方面。嗜热脂肪酶来源于古核嗜热菌 Aeropyrum pernix K1，在高温条件下能够保持很高的稳定性，对有机溶剂及变性... 详细信息

脂肪酶全称为三酰基甘油水解酶，能够催化酯水解和酯合成，属于水解酶中最重要的一类，广泛应用于工业、农业、医药等方面。嗜热脂肪酶来源于古核嗜热菌 Aeropyrum pernix K1，在高温条件下能够保持很高的稳定性，对有机溶剂及变性剂有很强的抗性。但古核嗜热菌培养条件苛刻，酶的获得十分困难。随着分子生物学技术的飞速发展，利用基因工程技术表达蛋白质成为常用的手段。以此为基础构建了表达嗜热脂肪酶的重组质粒并转化到大肠杆菌中，通过研究工程菌的培养条件，提高嗜热脂肪酶在大肠杆菌中的表达量，得到了大量的嗜热脂肪酶，为嗜热脂肪酶的进一步应用打下基础。我们从培养工程菌出发，通过发酵产酶，经热变性、Hitrap Q Sepharose 离子交换柱层析和 Sephacryl S-200 凝胶过滤层析获得了电泳纯的超嗜热脂肪酶。脂肪酶分子量为 63KDa 左右，非变性电泳及活力染色电泳确定其为单聚体蛋白。脂肪酶的酶学性质研究表明该酶的最适温度为 90℃，最适 pH 为 8.0。该酶具有极强的热稳定性，在 0.2mg/ml 的酶在 90℃半衰期为 12 小时，在 pH 偏碱性条件下稳定。本论文研究了重组嗜热脂肪酶表达菌株 *** BL21（DE3）的生长条件及产物表达规律，采用补加葡萄糖、蛋白胨的方法，通过控制诱导时间、接种量、pH、溶氧值和温度等条件进行发酵，优化了培养条件。最终发酵液在 600nm 的光密度值达到 54，每升发酵液的细菌湿重达 96g，脂肪酶活力达到 6.8×105U/L 发酵液。确定了工程菌培养的最佳条件，提高了目的蛋白和菌体的收获量。

关键词：嗜热脂肪酶嗜热菌基因基因表达

N-(2-甲基-6-乙基苯基)丙氨酸对映体的毛细管电泳分离

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高等学校化学学报 2003年第12期24卷 2165-2168页

作者：郑良玉张锁秦高贵曹淑桂张桂荣王智韩四平权静吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室吉林大学化学学院长春130023

采用高效毛细管区带电泳法 ,以β-环糊精及其衍生物作为手性选择剂 ,对外消旋 N -( 2 -甲基 -6-乙基苯基 )丙氨酸 ( EMPA)的两个对映体进行了手性分离 ,比较了环糊精种类、环糊精浓度、电解质溶液 p H值、温度和电场强度对分离的影响 .... 详细信息

采用高效毛细管区带电泳法 ,以β-环糊精及其衍生物作为手性选择剂 ,对外消旋 N -( 2 -甲基 -6-乙基苯基 )丙氨酸 ( EMPA)的两个对映体进行了手性分离 ,比较了环糊精种类、环糊精浓度、电解质溶液 p H值、温度和电场强度对分离的影响 .实验结果表明 ,采用 2 ,6-O-二甲基 -β-环糊精为手性选择试剂 ,环糊精浓度为 40 mmol/L、电解质溶液 p H=5 .5及温度为 2 0℃时分离效果最佳 ,对映体基本达基线分离 ,线性范围为2 0～ 2 0 0 mg/L,最低检测限为 1 0 mg/L.

关键词： N-(2-甲基-6-乙基苯基)丙氨酸对映体毛细管电泳手性分离除草剂

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衍生化气相色谱法分离2-辛醇对映体

分析化学 1998年第1期26卷 55-58页

作者：李斌杨红韩四平由德林冯雁董桓曹淑桂吉林大学酶工程实验室!长春130023

利用Ｒ－（＋）－苯乙基异氰酸酯与外消旋２－辛醇反应，产生相应的异氰酸酯非对映体衍生物，在气相色谱上得到分离，根据色谱图中两异构体峰面积差值，计算出对映体过量值，且与利用旋光仪测得的旋光纯度比较，结果相一致。相对误差... 详细信息

利用Ｒ－（＋）－苯乙基异氰酸酯与外消旋２－辛醇反应，产生相应的异氰酸酯非对映体衍生物，在气相色谱上得到分离，根据色谱图中两异构体峰面积差值，计算出对映体过量值，且与利用旋光仪测得的旋光纯度比较，结果相一致。相对误差＜±１％。该法只需微量样品就可以简单、快速、准确地测得对映体过量值。

关键词：气相色谱衍生化对映体分离 R-(+)-苯乙基异氰酸酯对映体过量值

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硅藻土固定化脂肪酶

吉林大学学报（理学版） 2002年第3期40卷 324-326页

作者：高贵韩四平王智翁梁王柏婧冯雁曹淑桂吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室长春130023

采用硅藻土作为载体 ,对脂肪酶进行固定化 ,研究了固定化条件对固定化脂肪酶的催化活性以及硅藻土吸附脂肪酶量的影响 .得到最适的固定化反应条件 :温度为 3 0～ 3 5℃ ;p H值为 7.7;缓冲液离子浓度在 0 .0 1～ 0 .0 3 mol/ L之间 ;载... 详细信息

采用硅藻土作为载体 ,对脂肪酶进行固定化 ,研究了固定化条件对固定化脂肪酶的催化活性以及硅藻土吸附脂肪酶量的影响 .得到最适的固定化反应条件 :温度为 3 0～ 3 5℃ ;p H值为 7.7;缓冲液离子浓度在 0 .0 1～ 0 .0 3 mol/ L之间 ;载体与脂肪酶的质量比为 8∶

关键词：固定化脂肪酶硅藻土固定化反应催化活性温度缓冲液物理吸附法

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新高考背景下的高中数学深度学习课堂构建

中学课程辅导 2023年第2期 72-74页

作者：韩四平元阳县第一中学

新高考背景下，高中数学课堂需向着转变课堂角色、重视思维培养等方向展开教学改革。教师应当以优化高中数学课程建设为目的，结合人教A版高中数学课堂教学案例，探究新高考背景为高中数学课堂教学带来的变化，将深度学习作为构建高效... 详细信息

新高考背景下，高中数学课堂需向着转变课堂角色、重视思维培养等方向展开教学改革。教师应当以优化高中数学课程建设为目的，结合人教A版高中数学课堂教学案例，探究新高考背景为高中数学课堂教学带来的变化，将深度学习作为构建高效课堂的突破口，设计构建深度学习课堂的有效策略，从而取得有效的教学成果。

关键词：高中数学深度学习课堂构建

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丁酸环氧丙酯的化学合成与酶法拆分

吉林大学自然科学学报 2001年第4期 78-80页

作者：刘志前王智杨硕郑良玉翁良李娜韩四平曹淑桂吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室长春130023

利用化学方法 ,由外消旋环氧氯丙烷出发 ,合成丁酸环氧丙酯 ,精制后可获得纯度96%以上的丁酸环氧丙酯 ,收率为 47% .利用猪胰脂肪酶进行不对称酯水解反应 ,可获得光学纯度为 93 .3 % ( ee值 )以上的

关键词：丁酸环氧丙酯化学合成脂肪酶拆分

微环境对脂肪酶催化拆分外消旋2－辛醇的影响

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生物化学杂志 1996年第3期12卷 377-379页

作者：杨红曹淑桂韩四平黄仲丽杨同书吉林大学酶工程国家重点实验室

微环境对脂肪酶催化拆分外消旋２－辛醇的影响　　　　　　　杨红，曹淑桂，韩四平，黄仲丽，杨同书（吉林大学酶工程国家重点实验室，长春１３００２３）手性２－辛醇不仅是制备液晶材料不可缺少的重要手性原料，也是合成具有光学活性... 详细信息

微环境对脂肪酶催化拆分外消旋２－辛醇的影响　　　　　　　杨红，曹淑桂，韩四平，黄仲丽，杨同书（吉林大学酶工程国家重点实验室，长春１３００２３）手性２－辛醇不仅是制备液晶材料不可缺少的重要手性原料，也是合成具有光学活性的医药和农药的重要手性中间体．本文...

关键词： 2-辛醇脂肪酶拆分微环境

应用AQC柱前衍生荧光检测脑蛋白水解液中的氨基酸

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中国生物制品学杂志 2003年第6期16卷 365-367页

作者：高贵翁樑韩四平王智马吉胜冯艳冯雁曹淑桂吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室长春130023 解放军四六一医院长春130021

目的利用AQC柱前衍生荧光对脑蛋白水解液中游离氨基酸进行检测。方法以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯(AQC)为柱前衍生化试剂,利用高压液相色谱荧光检测器系统考察氨基酸衍生和液相分离过程中的各种影响因素,检测脑蛋白... 详细信息

目的利用AQC柱前衍生荧光对脑蛋白水解液中游离氨基酸进行检测。方法以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯(AQC)为柱前衍生化试剂,利用高压液相色谱荧光检测器系统考察氨基酸衍生和液相分离过程中的各种影响因素,检测脑蛋白水解液中各种游离氨基酸含量。结果确定氨基酸的浓度在250μmol/L最为合适,准确的测定脑蛋白水解液中氨基酸的种类及含量。结论采用荧光检测器可以准确地测定蛋白质中氨基酸组成及含量。

关键词：荧光检测器脑蛋白水解液游离氨基酸 N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯 AQC

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β-葡萄糖苷酶的分离纯化和性质研究

生物学杂志 1997年第5期14卷 12-15页

作者：孙迎庆曹淑桂韩四平吉林大学酶工程国家重点实验室

采用分子筛和离子交换层析技术从黑曲霉Ｌ－２２菌株发酵液中分离提纯了一个由两个相同的亚基组成的β葡萄糖苷酶。研究了其酶学性质和底物专一性。

关键词： β-葡萄糖苷酶分离纯化性质