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布鲁氏菌外膜蛋白D15的表达及生物学活性分析

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中国预防兽医学报 2014年第4期36卷 273-276页

作者：孙晓庆韩先干宋军童永亮单雪芹丁铲胡青海于圣青中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为研究布鲁氏菌D15蛋白的生物学特性,本实验通过PCR技术扩增牛型布鲁氏菌外膜蛋白基因D15,并克隆至表达载体pCold TF中,构建重组表达质粒pCold-D15,原核表达了约为130 ku的His标记重组蛋白His-D15。Western blot结果显示:D15能够与布鲁... 详细信息

为研究布鲁氏菌D15蛋白的生物学特性,本实验通过PCR技术扩增牛型布鲁氏菌外膜蛋白基因D15,并克隆至表达载体pCold TF中,构建重组表达质粒pCold-D15,原核表达了约为130 ku的His标记重组蛋白His-D15。Western blot结果显示:D15能够与布鲁氏菌阳性牛血清发生特异性反应;并且具有纤连蛋白溶酶原结合活性,但不具有纤连蛋白结合活性。本研究为进一步研究D15蛋白在牛型布鲁氏菌感染、检测及亚单位疫苗的研制等方面的作用奠定基础。

关键词：牛型布鲁氏菌外膜蛋白生物学特性

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

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中国兽医科学 2012年第6期42卷 596-600页

作者：童永亮韩先干孙晓庆丁铲胡青海丁家波王豪举于圣青西南大学动物科技学院重庆400716 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 中国兽医药品监察所北京100081

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELIS... 详细信息

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。

关键词：牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体

禽巴氏杆菌C_(48-1)外膜蛋白H基因与鸡IL-18基因真核共表达载体的构建及表达

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中国兽医学报 2006年第4期26卷 382-384页

作者：曹素芳黄青云韩先干邓宪方华南农业大学兽医学院

根据鸡IL-18和真核质粒pcDNA 3的序列,设计1对特异性引物,以重组质粒pcDNA 3/IL-18为模板,扩增出具有完整真核表达结构的CM V-cIL-18-BGHpA片段。将此片段非定向插入重组表达质粒pcDNA 3/om pH中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定证实成... 详细信息

根据鸡IL-18和真核质粒pcDNA 3的序列,设计1对特异性引物,以重组质粒pcDNA 3/IL-18为模板,扩增出具有完整真核表达结构的CM V-cIL-18-BGHpA片段。将此片段非定向插入重组表达质粒pcDNA 3/om pH中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定证实成功构建了共表达禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因和鸡IL-18基因的重组表达质粒。将共表达质粒转染Cos7细胞,经RT-PCR、SDS-PAGE及W estern b lotting检测,证明了外膜蛋白H基因及鸡IL-18基因均获得了瞬时表达,为研究禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H的免疫原性和鸡IL-18在基因疫苗中的免疫调节作用奠定了基础。

关键词：外膜蛋白H基因鸡IL-18 丙烯酰胺凝胶电泳 Western blotting

实时荧光定量PCR检测RAW264.7巨噬细胞中Th1/Th2型细胞因子转录水平方法的建立及初步应用

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细胞与分子免疫学杂志 2013年第4期29卷 430-433页

作者：单雪芹韩先干张敏宋军刘海文田明星潘玲丁铲周锦萍于圣青安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 上海市动物疫病预防控制中心上海201103

目的建立小鼠RAW264.7巨噬细胞的Th1和Th2型细胞因子荧光定量PCR检测方法。方法依据GenBank中小鼠的β-actin基因序列、Th1型及Th2型细胞因子的核苷酸序列设计特异性引物,以RAW264.7巨噬细胞mRNA反转录后的cDNA为模板,通过构建质粒阳性... 详细信息

目的建立小鼠RAW264.7巨噬细胞的Th1和Th2型细胞因子荧光定量PCR检测方法。方法依据GenBank中小鼠的β-actin基因序列、Th1型及Th2型细胞因子的核苷酸序列设计特异性引物,以RAW264.7巨噬细胞mRNA反转录后的cDNA为模板,通过构建质粒阳性标准品,建立检测上述细胞因子转录水平的real-time PCR方法。结果用建立的荧光定量PCR方法,检测牛型布鲁氏菌S2308株感染RAW264.7巨噬细胞后,巨噬细胞Th1和Th2型细胞因子的转录水平。最低检测量为102拷贝/μL,线性关系很好,R2≥0.982,该方法具有良好的特异性和重复性。结论成功建立了检测巨噬细胞中Th1和Th2型细胞因子转录水平的荧光定量PCR方法。

关键词： Th1 Th2型细胞因子巨噬细胞RAW264 7 实时荧光定量PCR 布鲁氏菌

一种基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统的构建及评价

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生物工程学报 2021年第1期37卷 321-330页

作者：付立霞徐敬潇韩先干杨辉赖迎迢黄志斌龚建森农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室中国水产科学研究院珠江水产研究所广东广州510380 扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 中国农业科学院家禽研究所江苏扬州225125 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为构建一种具有广泛适用性的原核启动子报告系统,以质粒pFLX107为骨架,通过多克隆位点替换和序列改造,构建出基于lacZ基因和pUC复制子的pFGH系列报告载体,然后以lacZ基因缺失株MC4100为宿主菌筛选背景活性最低的质粒作为最终的报告系统... 详细信息

为构建一种具有广泛适用性的原核启动子报告系统,以质粒pFLX107为骨架,通过多克隆位点替换和序列改造,构建出基于lacZ基因和pUC复制子的pFGH系列报告载体,然后以lacZ基因缺失株MC4100为宿主菌筛选背景活性最低的质粒作为最终的报告系统,并利用诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM分别对其进行测试。结果显示,在所构建的pFGH系列质粒中,pFGH06的背景活性显著低于同系列其他质粒,在28℃培养条件下甚至显著低于低拷贝参考质粒pRCL的活性(P<0.01)。进一步的评估测试显示,质粒pFGH06可用于诱导型启动子或组成型启动子的克隆及活性测定,且在模拟应用于启动子筛选时,通过蓝白斑筛选即可实现对目标启动子的完全识别。与已报道的原核启动子报告系统相比,pFGH06具有体积小、克隆位点多、背景活性可调、对启动子筛选识别效率高等优点,具有广泛的应用前景。

关键词：报告基因 β-半乳糖苷酶定点突变启动子报告系统 pUC复制子阿拉伯糖启动子

信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌的调控作用

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中国农业科学 2012年第24期45卷 5110-5116页

作者：白灏韩先干刘蕾单雪芹宋军刘瑞董洪亮刘海文丁铲于圣青中国农业科学院上海兽医研究所

【目的】研究信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌(APEC)的调控作用。【方法】采用改良结晶紫半定量法和荧光染色法检测AI-2对APEC生物被膜形成能力的影响。Real-time PCR检测AI-2对APEC毒力基因转录水平的影响。活菌计数法观察AI-2对APEC... 详细信息

【目的】研究信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌(APEC)的调控作用。【方法】采用改良结晶紫半定量法和荧光染色法检测AI-2对APEC生物被膜形成能力的影响。Real-time PCR检测AI-2对APEC毒力基因转录水平的影响。活菌计数法观察AI-2对APEC黏附和入侵鸡胚成纤维细胞DF-1的影响。【结果】AI-2在浓度为0.185 mmol.L-1时,生物被膜形成能力显著增强,而浓度为0.037mmol.L-1和0.285mmol.L-1时,生物被膜形成能力无显著变化。Real-time PCR结果显示加入AI-2后,APEC毒力基因pfs,vat,luxS,tsh,fuyA,iucD转录水平显著下调,ompA和iss则上调。加入AI-2后,APEC对DF-1细胞的黏附和入侵能力分别下降到原来的57.35%和36.64%。【结论】AI-2对禽致病性大肠杆菌生物被膜形成具有浓度依赖性,在适宜浓度下能显著增强。AI-2能减弱禽致病性大肠杆菌毒力基因的转录水平和对DF-1的黏附和入侵能力。表明AI-2参与调控APEC致病性。

关键词：禽致病性大肠杆菌 AI-2 生物被膜毒力基因黏附入侵

鸭MAPK1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2014年第11期44卷 1150-1155页

作者：曹守林韩先干王少辉侯湾湾田明星丁铲王桂军于圣青中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036

为研制鸭丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)单克隆抗体,从樱桃谷鸭脾样品扩增鸭MAPK1基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建鸭MAPK1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白,经纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠... 详细信息

为研制鸭丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)单克隆抗体,从樱桃谷鸭脾样品扩增鸭MAPK1基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建鸭MAPK1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白,经纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA筛选分泌抗鸭MAPK1的单克隆杂交瘤细胞株,进行3次亚克隆纯化后,制备小鼠腹水。采用间接ELISA测定腹水效价,用Western-blot检测其特异性,并进行单克隆抗体的亚类鉴定。测序结果表明,鸭MAPK1基因编码区全长1 107bp,编码369个氨基酸。SDS-PAGE检测结果表明,本研究获得了可溶性的42ku的鸭MAPK1重组蛋白。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,得到2株抗鸭MAPK1的阳性杂交瘤细胞株,腹水效价均达到1∶12 800以上,均为IgG1亚类。Western-blot分析结果表明,制备的单克隆抗体具有良好的免疫反应特异性。以上结果表明,本研究成功制备了抗鸭MAPK1的单克隆抗体,为进一步研究其在先天免疫反应中的作用奠定了基础。

关键词：鸭 MAPK1基因克隆原核表达单克隆抗体

禽致病性大肠杆菌毒力基因多重PCR方法的建立和应用

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微生物学报 2014年第6期54卷 696-702页

作者：孟庆美王少辉韩先干韩月丁铲戴建君于圣青南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

【目的】建立禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)黏附相关基因、侵袭及毒素相关基因、抗血清存活相关基因及铁转运相关基因的多重PCR方法,实现禽致病性大肠杆菌毒力基因的简便、快速检测。【方法】根据GenBank... 详细信息

【目的】建立禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)黏附相关基因、侵袭及毒素相关基因、抗血清存活相关基因及铁转运相关基因的多重PCR方法,实现禽致病性大肠杆菌毒力基因的简便、快速检测。【方法】根据GenBank公布的基因序列,设计合成18对特异性引物,通过条件优化,建立四组多重PCR体系,并通过模板倍比稀释检测各组多重PCR的灵敏性。利用多重PCR检测100株APEC毒力基因的分布,验证多重PCR方法的可行性。【结果】根据PCR扩增片段大小判定,上述四组多重PCR体系均能同时扩增出该组中的各个毒力基因,且灵敏度分别为:103CFU、103CFU、105CFU、105CFU细菌和1ng、1ng、10ng、10ng DNA。100株APEC的毒力因子检测结果显示,多重PCR和单基因PCR结果一致。【结论】建立的四组多重PCR方法能够简便、快速地检测禽致病性大肠杆菌的毒力基因,可用于毒力基因的鉴定以及流行病学调查。

关键词：禽致病性大肠杆菌毒力基因多重PCR 检测

禽致病性大肠杆菌安徽分离株luxS和pfs基因的克隆、表达与细胞外合成AI-2活性检测

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微生物学报 2012年第9期52卷 1167-1172页

作者：韩先干白灏刘蕾陈文静丁铲胡青海祁克宗于圣青中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 安徽农业大学动物科技学院合肥230036

【目的】LuxS/AI-2型密度感应系统存在于革兰氏阴性和阳性菌中,可产生用于细菌种间交流的通用自诱导信号分子AI-2(Autoinducer-2,AI-2),细菌许多生理功能都受此系统的调节。本研究开展对禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia ... 详细信息

【目的】LuxS/AI-2型密度感应系统存在于革兰氏阴性和阳性菌中,可产生用于细菌种间交流的通用自诱导信号分子AI-2(Autoinducer-2,AI-2),细菌许多生理功能都受此系统的调节。本研究开展对禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)自诱导信号分子AI-2的检测和建立体外合成、定量的方法,为进一步研究APEC的AI-2调控作用奠定基础。【方法】利用哈维弧菌BB170(Vibrio harveyi BB170)开展对APEC AI-2的检测;利用表达、纯化的LuxS和Pfs在体外催化S-腺苷同型半胱氨酸(Sadenosylhomocysteine,SAH),进行AI-2的体外合成。【结果】APEC能产生自诱导信号分子AI-2;成功表达可用于AI-2合成的可溶性重组蛋白LuxS和Pfs;纯化的重组蛋白LuxS和Pfs与SAH同时作用后,合成了浓度为300μmol/L的AI-2;运用哈维弧菌BB170对合成的AI-2活性检测表明,其活性是阴性对照的700倍。【结论】APEC存在LuxS/AI-2型密度感应系统,APEC的LuxS和Pfs可以在体外催化SAH生成有活性的AI-2分子。本研究为进一步研究APEC的AI-2的调控作用奠定基础。

关键词：禽致病性大肠杆菌密度感应系统信号分子AI-2 LuxS