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HCN通道调节背根节神经元P2X受体功能参与神经痛

HCN通道调节背根节神经元P2X受体功能参与神经痛

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作者：雷晓露遵义医学院

学位级别：硕士

背根节(Dorsal root ganglion,DRG)神经元是感觉传入初级神经元,DRG神经元负责接受和整合感觉信息,进而将之传递到脊髓。有研究证实表达于DRG神经元的超级化激活环核苷酸门控(hype.polarization-activate. cyclic nucle.tide.gate.,HCN... 详细信息

背根节(Dorsal root ganglion,DRG)神经元是感觉传入初级神经元,DRG神经元负责接受和整合感觉信息,进而将之传递到脊髓。有研究证实表达于DRG神经元的超级化激活环核苷酸门控(hype.polarization-activate. cyclic nucle.tide.gate.,HCN)通道的激活可增高DRG神经元兴奋性,从而促进病理性疼痛的产生。此外,嘌呤能P2X受体在DRG神经元均有表达,尤其是P2X受体选择性表达于与伤害性感受密切相关的中小型DRG神经元,研究表明在多种神经病理性疼痛模型中DRG神经元P2X受体的激活促进了神经痛的发生、发展。HCN通道与P2X受体均表达于DRG神经元,且HCN通道与P2X受体的激活均可促进神经痛的产生,但目前尚不清楚DRG神经元HCN通道与P2X受体之间是否存在相互作用继而参与神经痛的调节。本课题通过制作大鼠坐骨神经慢性缩窄性损伤(chronic constriction injury of sciatic ne.ve.CCI)模型,结合在体和离体研究,观察:1)背根节HCN通道在神经病理性疼痛中的作用以及对背根节P2X受体表达的影响;2)HCN通道对培养的DRG神经元P2X受体功能的调节作用。本课题从不同角度探讨HCN通道对DRG神经元P2X受体的调节作用,从而参与神经病理性疼痛的调节。目的:1.观察HCN通道在神经病理性疼痛中的作用及其对背根节P2X受体表达的影响。2.观察HCN通道对培养的背根节神经元P2X受体功能的调节作用。方法:1.在体实验:实验分组:7w(体质量18000g)成年雄性SD大鼠40只随机分为5组(n=8):(1)sham组(假手术组);(2)CCI组(鞘内注射生理盐水);(3)CCI+ZD7288组(鞘内分别注射10,30,50μg ZD7288)。Sham组大鼠不予鞘内置管,仅游离坐骨神经,不结扎。其余各组大鼠在鞘内置管5d后行CCI术,术后鞘内给药(1次/d,持续14d)。行为学检测机械缩足阈值(me.hanical withdrawal thre.hold,MWT);免疫印迹技术(We.te.n Blot,WB)检测背根节P2X、P2X受体表达。2.离体实验:培养2w SD幼鼠DRG神经元分为4组:(1)ATP组(100μmol/L ATP);(2)ZD7288+ATP组(10,100,1000μmol/L ZD7288预孵育10min后,给予ATP);(3)8-Br-cAMP+ATP组(100μmol/L 8-Br-cAMP预孵育5min后,给予ATP);(4)ZD7288+8-Br-cAMP+ATP组(先加100μmol/L ZD7288孵育5min,再加100μmol/L 8-Br-cAMP孵育5min,最后加ATP)。采用MPS-2多通道快速微量加药系统细胞外给予ATP(100μmol/L,2s),全细胞膜片钳技术记录DRG神经元ATP诱发的电流。结果:1.大鼠CCI术后1d即形成稳定的机械痛敏,MWT明显缩短(P<0.05);鞘内注射30μg HCN通道阻滞剂ZD7288可明显延长CCI大鼠MWT(P<0.05)。WB结果说明,CCI大鼠术侧L背根节P2X受体、P2X受体表达明显增加(P<0.05);鞘内给予HCN通道阻滞剂ZD7288可显著降低CCI大鼠背根节P2X受体、P2X受体的表达(P<0.05)。2.培养的背根节神经元可记录到三种ATP内向电流:快速脱敏感反应电流(快I),慢速脱敏感反应电流(慢I)及先快后慢的混合电流(混合I);HCN通道阻滞剂ZD7288(100μmol/L,10min)可明显抑制DRG神经元快I、慢I、混合I幅值(P<0.05),ZD7288对DRG神经元ATP电流的抑制作用呈现剂量依赖性;8-Br-cAMP(100μmol/L,cAMP的类似物)可增强DRG神经元的ATP电流,ZD7288(100μmol/L)预孵育10min可显著抑制8-Br-cAMP的效应。结论:1.背根节HCN通道表达增加可促进CCI所致的神经痛的发生与维持,同时可促进CCI大鼠背根节嘌呤能P2X、P2X受体的表达。***通道的激活可增强背根节神经元P2X受体功能,其机制可能涉及cAMP-PKA信号途径。

关键词：神经病理性疼痛 HCN通道背根节神经元 P2X受体

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内生性村务监督的起源与逻辑——基于浙江高禹村民主监督理事会的考察

内生性村务监督的起源与逻辑——基于浙江高禹村民主监督理事会的...

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作者：马真露华中师范大学

学位级别：硕士

民主监督是村民自治的关键环节和重要保障。30多年来,我国村民自治在实践中不断深入发展。但迄今为止,村民自治中“四个民主”的发展并不均衡,民主监督相对滞后和薄弱。如何进一步加强村级民主监督,规范村级公共权力运行,提高基层治理能... 详细信息

民主监督是村民自治的关键环节和重要保障。30多年来,我国村民自治在实践中不断深入发展。但迄今为止,村民自治中“四个民主”的发展并不均衡,民主监督相对滞后和薄弱。如何进一步加强村级民主监督,规范村级公共权力运行,提高基层治理能力,成为多地关注和探索的焦点。浙江省安吉县高禹村的民主监督理事会便是创新实践之一。高禹村民主监督理事会的产生源于现行村务监督机制中监委主任兼任、成员数量不足和监督内容不全的制度缺陷,以及监督制度在实践运行中偏离而导致的监督代表性不足、监督信息难获取、监督弹性较大等问题。这为高禹村埋下了村民质疑村干部的信任隐患。村集体经济增收后,村民对集体资产的使用和管理更加关注,促使信任隐患不断发酵和升级,进而导致信任危机爆发。面对这一局面,该村村委决定重建新型监督组织的想法应运而生。在村委带领和村民参与下,通过推选成员、明确分工完成了组织创设以及群策群力下制定系列监督规则完成理事会的建立。理事会建立起来后,不断协调与村级党组织、村民委员会、村务监督委员会之间关系,实现了组织间的良性互动。此外,理事会不断创新监督方式,丰富监督载体,取得了健全与完善村务民主监督机制,唤醒和激活村庄内生监督活力,规范和透明村级公共权力运行的成效。高禹村民主监督理事会发端于村庄内部,是高禹人发挥个体创造力、充分动员村民、主动创造的结果。理事会的组织产生、规则制定、监督方式等方面与本村依据法律规定的统一要求建立的村务监督委员会体制显著不同。如果说这种统一建立的村务监督机构具有制度化、规范化以及强制性,是一种自上而下、由外及里、依法统一建设的方式,属于外源式或外生性村务监督体制的话。那么,民主监督理事会则是内生性村务监督体制,具有村民自发性、自主性以及创造性。民主监督理事会的组织创设、规则制定以及监督运转呈现出内生性。内生性村务监督为新时代背景下农村基层村务监督提供了可行的实践方式,形成了独特的高禹经验,取得了较好的监督效果。这种监督方式之所以能在高禹村生成是多种因素共同作用的结果,现行村务监督机制在制度规定和实践运行中的缺陷与村民日益增长的优化监督诉求催生建立理事会的内生需求,村庄精英的驱动与村民的参与使内生成为可能,制度提供的空间和地方政府的支持使理事会建立和运行有了保障。

关键词：村务监督民主监督理事会内生性

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成渝经济区产业集聚与技术创新研究

成渝经济区产业集聚与技术创新研究

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作者：姚建露重庆工商大学

学位级别：硕士

产业集聚是国家经济发展的重要产业组织形式,技术创新则是促进产业集聚升级发展的主要实现方式,产业集聚的升级发展又进一步提升技术创新,产业集聚与技术创新之间的良性互动是持续促进区域乃至整个国家经济增长的重要动力。因此本文以... 详细信息

产业集聚是国家经济发展的重要产业组织形式,技术创新则是促进产业集聚升级发展的主要实现方式,产业集聚的升级发展又进一步提升技术创新,产业集聚与技术创新之间的良性互动是持续促进区域乃至整个国家经济增长的重要动力。因此本文以成渝经济区为研究背景,重点研究成渝经济区工业产业集聚、技术创新以及两者之间的关系,并就实证结果进行路径探索来达到提升成渝经济区产业集聚水平以及技术创新能力的目的。本文主要分为八个章节。第一章包括研究背景、意义,研究对象的界定,研究内容、方法以及创新点;第二章主要综述了国内外在该领域的研究动态;第三章主要梳理了产业集聚理论、技术创新理论以及产业集聚与技术创新两者之间的作用机制,为后文进行产业集聚与技术创新关系研究作一个理论铺垫;第四章主要进行成渝经济区产业集聚水平的测度与分析;第五章主要进行成渝经济区技术创新能力的测度与分析;第六章进行成渝经济区产业集聚与技术创新的关系研究;第七章是结合实证结果对提升成渝经济区产业集聚水平与技术创新能力进行的路径探索;第八章主要是本文的研究结论以及展望。通过分析产业集聚理论与技术创新理论发现,产业集聚与技术创新两者呈正相关关系,但只有集聚水平较高时,对技术创新的促进作用才明显。通过分析成渝经济区产业集聚水平与技术创新能力得出:一是产业集聚方面。成渝经济区依托天然的区位优势已拥有大量的优势产业;且形成了不同程度的产业集聚,产业集聚多形成在重庆市、成都及其周边地区。从2000-2013年变化趋势来看,成渝经济区产业集聚水平逐年递增。二是技术创新方面。在2013年,成渝经济区创新投入、产出占比较大的区域是重庆市、成都市、绵阳市以及德阳市。从2000-2013年变化趋势来看,成渝经济区技术创新能力逐年递增。三是产业集聚与技术创新关系方面。成渝经济区产业集聚是技术创新的格兰杰原因,且为正向作用;但技术创新不是产业集聚的格兰杰原因。说明目前成渝经济区产业集聚水平不高,对技术创新作用不明显。最后,为提升成渝经济区产业集聚水平与技术创新能力进行路径探索。

关键词：成渝经济区产业集聚技术创新

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心脏瓣膜置换术后左室功能障碍的危险因素分析及预测模型建立

心脏瓣膜置换术后左室功能障碍的危险因素分析及预测模型建立

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作者：王佳露兰州大学

学位级别：硕士

目的:探讨行心脏瓣膜置换(HVR)患者术后左室功能障碍(LVD)的危险因素,建立一个可靠、准确的临床预测模型,为早期识别HVR术后LVD的高危患者提供依据。方法:本研究回顾性连续选取2020年1月至2020年12月在兰州大学第一医院心外科接受HVR治... 详细信息

目的:探讨行心脏瓣膜置换(HVR)患者术后左室功能障碍(LVD)的危险因素,建立一个可靠、准确的临床预测模型,为早期识别HVR术后LVD的高危患者提供依据。方法:本研究回顾性连续选取2020年1月至2020年12月在兰州大学第一医院心外科接受HVR治疗的患者作为研究对象。依据纳入和排除标准,最终共纳入了258例患者,收集患者的相关临床资料,根据术后是否发生LVD,将患者分为LVD组和Non-LVD组。使用单因素分析及多因素Logistic回归分析筛选出HVR术后LVD的独立危险因素,建立风险预测模型。使用R软件绘制列线图,使用受试者工作特征曲线(ROC)和校准图对预测模型进行评价,使用Hosme.-Le.e.how拟合优度检验评估预测模型的拟合度,使用Bootstrap自抽样法对预测模型进行内部验证。结果:1.单因素分析结果显示,在性别、房颤史、肺动脉高压史、冠心病史、心功能分级、总胆红素、白蛋白、左心室舒张末内径(LVe.D)、左心室收缩末内径(LVe.D)、左房前后径、左室射血分数(LVe.)和体外循环时间(CPB)方面,LVD组和Non-LVD组的差异具有统计学意义(Pe.D≥70.5 mm、LVe.e.-Le.e.how拟合优度检验结果显示X=8.259,P=0.409>0.05,表明模型的拟合度较好;采用Bootstrap自抽样法进行模型的内部验证,C-inde.为0.888,表明本研究建立的HVR术后LVD的预测模型的区分度和校准度均较好。结论:1.术前肺动脉高压史、冠心病史、白蛋白e.D≥70.5 mm、LVe.<54.5%、CPB时间≥125.5 min是HVR术后LVD发生的独立危险因素,临床工作中应密切关注。2.基于上述危险因素构建的预测模型具有良好的预测效能,有助于提高早期识别HVR术后LVD高危患者的能力,以便及时做出干预,改善患者的预后,具有重要的临床价值。

关键词：心脏瓣膜置换术左室功能障碍危险因素预测模型列线图

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DB公司汽车总装线物流配送策略研究

DB公司汽车总装线物流配送策略研究

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作者：毛露华中科技大学

学位级别：硕士

因经济的飞速发展和人民生活水平的提高,最终致使汽车销售市场的整车可获的利润在逐渐变少。此外,顾客对订单处理时间、配送服务质量等的要求也逐渐升高。汽车生产商能否保住自己现有的市场份额,并不断扩大现有市场,提高生产零部件配送... 详细信息

因经济的飞速发展和人民生活水平的提高,最终致使汽车销售市场的整车可获的利润在逐渐变少。此外,顾客对订单处理时间、配送服务质量等的要求也逐渐升高。汽车生产商能否保住自己现有的市场份额,并不断扩大现有市场,提高生产零部件配送效率是非常紧要的。生产零部件配送效率高,生产就会按计划顺利进行,企业就可以让产品快速抵达顾客。因此,在提高零部件物流配送效率的同时并降低人工、设备等成本已经成为汽车行业现今急需解决的问题。本文以实际的DB公司为研究背景,系统分析了DB公司物料配送现状,它主要的配送问题有出货不均衡、中转车辆卸货等待时间长、线边暂存区管理混乱这三个,主要导致原因是配送模式一刀切,对所有的零件进行集中配送。最终本文提出了针对配送模式的合理配送物料分类并给出了具体分类标准,即通用率、体积、包装数。DB公司已有kitting、kanban、line.stocking这三种配送模式,在提出物料分类后这三种模式的配送规则也发生了变化,然后结合配送物料分类标准改善后的三种模式适合配送的零件和物料分类得出了四种配送策略。本文最后构建了以人工成本、设备成本、在制品持有成本为目标的模型,通过对四种策略和DB公司原有运行结果进行计算、比较,最后得到了比DB公司原有运行状况更好的策略,从而证明了配送物料分类的有效性。

关键词：混流装配线配送物料分类配送模式

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层状结构优化与填料形态结构设计增强复合材料电磁防护性能研究

层状结构优化与填料形态结构设计增强复合材料电磁防护性能研究

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作者：黄明露西南大学

学位级别：硕士

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可行能力理论视角下城市流浪儿童社会救助问题研究——以沈阳市为例

可行能力理论视角下城市流浪儿童社会救助问题研究——以沈阳市为...

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作者：柴露辽宁大学

学位级别：硕士

流浪儿童的存在是一个亟待解决的现实问题。近年来,这一问题对很多相关机构和学者造成了困扰,所以对流浪儿童进行社会救助也成为了全球各个国家需要尽快解决的一个难题。本文是立足当前沈阳市流浪儿童在社会救助方面所存在的很多问题,... 详细信息

流浪儿童的存在是一个亟待解决的现实问题。近年来,这一问题对很多相关机构和学者造成了困扰,所以对流浪儿童进行社会救助也成为了全球各个国家需要尽快解决的一个难题。本文是立足当前沈阳市流浪儿童在社会救助方面所存在的很多问题,分析问题产生的深层原因并提出具体可行的建议。全文共分为五个部分。第一部分,绪论。论述本文的选题缘起、选题依据、背景,研究目的、意义和方法,还介绍了国内外研究状况、本文的研究方法及创新点。第二部分,相关概论的界定与理论内涵。包括儿童、流浪儿童、社会救助的概念以及对阿玛蒂亚·森可行能力理论的概述,从五个工具性自由：政治自由、经济条件、社会机会、透明性保证、防护性保障等方面进行阐释,然后介绍该理论在本文中的应用。第三部分,全面了解沈阳市流浪儿童社会救助的现状,以及深入分析救助现状中存在的问题,主要从缺少政策法规引导,人力物力财力资源不足,专业人才短缺以及救助方法不够专业化等方面来分析。第四部分,针对当前沈阳市流浪儿童社会救助中存在的问题,运用可行能力理论分析其产生的原因,找出导致这种现象的内在原因,包括资金配置与经费来源不充分,相关限制导致的社会机会不平衡,监管制度与获取信息透明性不健全,缺乏相关法律法规防护性保障等方面。第五部分,通过对原因的综合分析与考虑,运用阿玛蒂亚·森可行能力理论提出解决沈阳市流浪儿童社会救助的有效对策,并制定出行之有效的政策安排。本文采用调查研究法、文献分析法、实证研究法等相结合的方式,以阿玛蒂亚·森可行能力为理论依据,找出当前沈阳市流浪儿童社会救助方面存在的很多问题,分析原因并提出一些合理化建议来指导政府的行为。儿童的今天就是祖国的明天,流浪儿童社会救助问题处理得当,有益于促进和推动社会和谐稳定的发展。

关键词：可行能力社会救助经济条件社会参与防护性保障

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仿生形态在童装设计中的应用研究——以猪元素为例

仿生形态在童装设计中的应用研究——以猪元素为例

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作者：李月露湖南师范大学

学位级别：硕士

仿生从远古时代发展到现代,伴着社会的发展而与时俱进,仿生设计的思维方式已经受到各设计领域的一致认同。仿生设计带给人类无尽的灵感源泉以不同形式充斥在生活中的各个角落,对我们的吃穿住行产生重大影响。它对于儿童的影响更甚,仿生... 详细信息

仿生从远古时代发展到现代,伴着社会的发展而与时俱进,仿生设计的思维方式已经受到各设计领域的一致认同。仿生设计带给人类无尽的灵感源泉以不同形式充斥在生活中的各个角落,对我们的吃穿住行产生重大影响。它对于儿童的影响更甚,仿生形态设计以“形”、“意”结合设计为基础指导童装设计的发展,从日常穿着上对儿童起到启蒙教育,具有激发儿童兴趣、提高儿童认知能力等影响,同时在与动画市场、玩具市场紧密接轨的情况下拥有创造童装市场经济效益,提高设计附加值等意义。本文详细论述童装中仿生形态设计需要的基本理论,主要对4-6岁学龄前儿童进行分析,从该段儿童的生理心理特征、认知程度着手,以仿生形态设计为切入点分析仿生形态在童装设计的理论与现实意义,探求符合学龄前儿童身心发展的设计方式来创造童装设计的附加值。通过对现有的童装仿生设计的应用现状进行调查分析,并以猪元素的仿生形态设计来阐述自己见解,使得研究具有一定的实际意义。将猪为仿生对象进行仿生形态设计实践,也为其他仿生元素的设计起到借鉴和指导作用。以仿生形态进行猪元素童装的设计,在服装的整体造型、局部装饰点缀上实践增加童装的视觉效果,来引起儿童的关注与兴趣,从而对儿童审美能力的培养以及想象力的激发具有一定的积极影响作用。

关键词：仿生形态学龄前儿童童装设计猪元素

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虚拟产业集群中技术联盟稳定性研究

虚拟产业集群中技术联盟稳定性研究

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作者：唐雅露长沙理工大学

学位级别：硕士

随着知识经济快速发展,技术研发难度增大,很多企业选择技术联盟突破技术难关和提升核心竞争力。而我国技术联盟中接近50%是不稳定的,甚至是失败的。在此背景下,本文对虚拟产业集群中技术联盟稳定性影响因素进行研究,这对解决现实中虚拟... 详细信息

随着知识经济快速发展,技术研发难度增大,很多企业选择技术联盟突破技术难关和提升核心竞争力。而我国技术联盟中接近50%是不稳定的,甚至是失败的。在此背景下,本文对虚拟产业集群中技术联盟稳定性影响因素进行研究,这对解决现实中虚拟产业集群中技术联盟高失败率和不稳定性问题具有非常重要的意义。本文针对技术联盟运行过程中出现的问题,结合虚拟产业集群的特征,从联盟参与主体角度,利用因子分析法提取出能够反映虚拟产业集群特征的技术联盟稳定性影响因素;利用FCM法构建虚拟产业集群中技术联盟稳定性影响因素模型,并从中找出影响虚拟产业集群中技术联盟稳定性的核心关键影响因素;对技术联盟稳定性的核心关键影响因素进行情景模拟分析,并通过参数设置和迭代推理验证核心关键影响因素对技术联盟稳定性的影响。本研究提取影响虚拟产业集群中技术联盟稳定性的影响因素,并找出影响虚拟产业集群中技术联盟稳定性的6个关键因素,分别为市场、政府、网络、联盟合作机制、联盟成员、联盟目标完成度。从构建的虚拟产业集群中技术联盟稳定性影响因素模型中得出:政府、联盟合作机制、联盟目标完成度是影响虚拟产业集群中技术联盟稳定性的核心关键影响因素。联盟合作机制因素对技术联盟稳定性的影响程度最大,其次是联盟目标完成度,而政府因素对技术联盟稳定性影响程度不如前面二者。针对虚拟产业集群中技术联盟稳定性的核心关键影响因素提出对策建议:在技术联盟组建初期,要重视技术联盟外部环境的作用,尤其是加强政府对虚拟产业集群中技术联盟的支持与引导作用;在技术联盟运行阶段,完善基于技术联盟核心关键影响因素的联盟合作机制建设;在技术联盟运行全过程中合理设置技术联盟目标。

关键词：虚拟产业集群技术联盟稳定性模糊认知图

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真菌蛋白激发子Pe.T1与烟草膜蛋白胡作特性研究

真菌蛋白激发子PeaT1与烟草膜蛋白胡作特性研究

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作者：孟繁露中国农业科学院

学位级别：硕士

植物对病原微生物的识别机制已经成为植物免疫领域的研究热点，越来越多的人把目光锁定在寻找激发子的受体上，以期从激发子与植物受体互作的角度更深层次地了解植物免疫防御机制。迄今为止，虽然已经有许多关于激发子受体的报道，但整... 详细信息

植物对病原微生物的识别机制已经成为植物免疫领域的研究热点，越来越多的人把目光锁定在寻找激发子的受体上，以期从激发子与植物受体互作的角度更深层次地了解植物免疫防御机制。迄今为止，虽然已经有许多关于激发子受体的报道，但整体研究进展缓慢。本文在前期研究的基础上，从烟草质膜中分离到一种真菌蛋白激发子Pe.T1的互作蛋白，克隆获得互作蛋白编码基因序列并成功得到原核细胞表达的重组蛋白，用Far-We.te.n Blot、免疫共沉淀和双分子荧光互补等多种研究蛋白互作的方法验证了Pe.T1与其互作蛋白在植物体内和体外的结合特性，推测该互作蛋白可能是蛋白激发子Pe.T1在烟草上的潜在识别受体。本研究为植物对真菌蛋白激发子的识别机制研究提供了理论依据，具体研究结果如下： 1.获得了Pe.T1在烟草细胞质膜上的互作蛋白并对其进行了功能分析。利用Far We.te.n Blot方法从烟草膜蛋白双向电泳凝胶中钓取Pe.T1的互作蛋白，质谱鉴定结果表明，获得的Pe.T1互作蛋白是一个22KD的跨膜多肽(Ge.Bank: CAA65195.1)，属于膜蛋白家族DRe.P(de.e.opme.talre.ulate. plasma me.brane.prote.n)。Blast序列比对分析表明，Pe.T1互作蛋白与Ca结合蛋白PCaPs的N端序列有同源性，该蛋白N端序列与磷酸化、Ca变化等信号传导的早期事件密切相关，是拟南芥细胞膜上介导信号传递的重要因子。 2.克隆得到了Pe.T1互作蛋白的CDS序列。提取烟草叶片的mRNA并反转录成cDNA，根据Pe.T1互作蛋白的编码区序列设计特异性引物，克隆得到全长594bp的CDS序列，该序列编码包含197个氨基酸的蛋白多肽，多肽理论分子量为22kDa.。 3． Pe.T1互作蛋白定位在烟草细胞膜上。将克隆得到的Pe.T1互作蛋白CDS序列分别插入到含有绿色荧光蛋白GFP标签的瞬时表达载体pGDG和含有红色荧光蛋白RFP标签的瞬时表达载体pGDR中，重组载体分别转化农杆菌LBA4404并注射烟草叶片，激光共聚焦显微镜观察发现，表达蛋白定位于烟草质膜，进一步印证了分离到的Pe.T1互作蛋白是一种烟草膜蛋白。 4．建立了Pe.T1互作蛋白大肠杆菌表达体系，获得了可溶性表达的烟草膜蛋白。将Pe.T1互作蛋白的CDS序列插入不同表达载体，通过筛选得到该互作蛋白的最优表达载体pe.-30His。将构建好的重组表达载体转化e. coli Transe.ta细胞，通过诱导表达条件筛选获得可溶性重组表达蛋白，并将该蛋白命名为Pe.T1-BP。利用亲和层析和阴离子交换技术纯化重组膜蛋白，并用SDS-PAGe.测其纯度，考马斯亮蓝染色显示一条带。 5.表达蛋白Pe.T1-BP能与Pe.T1在体外特异结合。用Far-We.te.n Blot方法检测到表达蛋白Pe.T1-BP经变性电泳SDS-PAGe.仍能和表达蛋白Pe.T1结合，证明二者在变性条件下可以互作;用免疫共沉淀的方法检测到表达纯化的蛋白Pe.T1-BP和Pe.T1在生理条件下可以稳定结合。 6.膜蛋白Pe.T1-BP与Pe.T1在烟草细胞内结合。为了进一步证实Pe.T1-BP和Pe.T1的相互作用，将二者的CDS序列分别连入双分子荧光标记(BiFC)载体pSCYNe.pSCYCe.，重组载体分别转化农杆菌LBA4404，并利用农杆菌渗入法处理烟草叶片。荧光显微镜观察到烟草细胞膜周围有青色荧光，证明两种蛋白在烟草细胞内瞬时表达并稳定结合。

关键词：蛋白激发子受体膜蛋白蛋白互作表达纯化信号传导

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