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全反式维甲酸联合TK基因对骨肉瘤U-2细胞旁观者效应的研究

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全反式维甲酸联合TK基因对骨肉瘤U-2细胞旁观者效应的研究

作者：霍洪亮山西医科大学

学位级别：硕士

研究背景：骨肉瘤是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤之一,其恶性程度较高,发现时常已有微小肺转移,预后普遍较差,而且缺乏有效的治疗手段。而骨肉瘤的基因治疗是最有希望的治疗方法之一,在综合治疗中也是极其重要的部分。其中,... 详细信息

研究背景：骨肉瘤是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤之一,其恶性程度较高,发现时常已有微小肺转移,预后普遍较差,而且缺乏有效的治疗手段。而骨肉瘤的基因治疗是最有希望的治疗方法之一,在综合治疗中也是极其重要的部分。其中,自杀基因（suicide gene）/前药（prodrug）系统受到广泛的重视,单纯疱疹病毒-胸苷激酶（HSV-tk）/丙氧鸟苷（GCV）系统是目前研究最多的用来评价自杀基因的治疗效果。但是操作复杂,有危险性,故选择经济、相对安全的Lipofectamine2000脂质体介导的转染方法,将重组质粒pIRES-EGFP-tk成功导入人骨肉瘤U-2细胞中。在自杀基因系统的旁观者效应（Bystander effect）更是引起肿瘤消退的重要因素,该系统的治疗机制是通过基因转移载体将自杀基因导入肿瘤细胞中,自杀基因表达蛋白,在这种蛋白作用下,在肿瘤组织局部激活本身无毒或低毒的前药（prodrug）,将其转化为具有高度毒性的代谢产物,从而将肿瘤细胞杀灭。旁观者效应的物质基础是细胞缝隙连接（GJ）,GJ由六个表达在细胞表面的同亚型连接蛋白（Cx）构成的。同类细胞间的GJ传导能量或信息作用最强,由它介导的细胞间通讯（GJIC）可以决定细胞的正常分化和生长。Cx表达低下或位于胞浆内时,功能性GJ就不能形成。当GJIC功能低下时，提示细胞恶性生长、增殖或异常分化。骨肉瘤细胞中的Cx43蛋白的浓度与肿瘤细胞的分化程度成正相关,提示Cx43能影响骨肉瘤细胞的发展。因此,我们可以以Cx43蛋白的变化来观察plRES-EGFP-TK/GCV系统的旁观者效应,plRES-EGFP-TK/GCV系统抗肿瘤效果不明显,或对某些肿瘤细胞无效的原因可能TK基因转染效率低或旁观者效应低。旁观者效应可以通过基因转染Cx基因或化学辅助方法来提高。据目前研究Cx基因转染效率不是很高,所以诱导Cx表达的化学诱导剂则应用更广泛，这些诱导剂一般对机体无毒或毒性极低,包括维甲酸、cAMP、类胡萝卜素、糖皮质激素等,在诱导Cx表达时存在细胞组织特异性和Cx类型特异性。全反式维甲酸作为一种良好的诱导剂和分化剂,与常规化疗药相比,副作用低,不良反应较少,还能明显的降低肿瘤的恶性程度。本实验我们以人骨肉瘤U-2细胞株为研究对象,全反式维甲酸作用后,观察人骨肉瘤U-2细胞膜上Cx43蛋白含量的变化,从而观察全反式维甲酸能否增强plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞的杀伤力和旁观者效应。目的：观察全反式维甲酸联合脂质体介导的TK/丙氧鸟苷（GCV）系统对人骨肉瘤U-2细胞旁观者效应的影响。方法：订购重组质粒plRES-EGFP-TK,培养和转染人骨肉瘤L2细胞株,荧光倒置显微镜和流式细胞仪观察转染后细胞生长状态,四甲基偶氮哇蓝（MTT）法检测plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞的生长抑制率,以及联合ATRA与否是否增强其旁观者效应,ELISE检测细胞培养液中连接蛋白（CX）43的表达情况。结果： ATRA可以抑制U-2细胞生长,当终浓度为10-（?）mol/l时,明显降低细胞存活率,形态学上主要以细胞凋亡形式出现;当终浓度为10-7mol/1时,无抑制细胞生长作用。ATRA抑制U-2细胞生长呈浓度一时间依赖性（p＜0.05）。plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞旁观者效应在TK+:TK-细胞混合比例为5：5时明显出现（p＜0.05）,而联合ATRA后,在TK+:TK细胞混合比例为3：7时就明显出现（p＜0.05）,且在细胞生存率均在50%的时候,TK+细胞比例可下降20%。ATRA （10-6mol/1）处理人骨肉瘤U-2细胞24h、48h、72h后,Cx43蛋白的浓度分别为O.559±0.018ng/ml,0.654±0.023ng/ml.,0.826±0.065ng/ml（p＜0.01）结论：全反式维甲酸可能通过增强CX43的表达,提高plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞的杀伤效应。

关键词： TK基因骨肉瘤全反式维甲酸旁观者效应

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中国林蛙雌性繁育技术的研究

中国林蛙雌性繁育技术的研究

作者：霍洪亮东北师范大学

学位级别：硕士

本文以中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)蝌蚪为材料，采用在蝌蚪饲料中添加性激素的方法，观察中国林蛙蝌蚪在个体发育过程中，性激素对中国林蛙蝌蚪性别分化、性腺发育的诱导作用。旨在讨论中国林蛙性别控制的最佳途径和最佳方... 详细信息

本文以中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)蝌蚪为材料，采用在蝌蚪饲料中添加性激素的方法，观察中国林蛙蝌蚪在个体发育过程中，性激素对中国林蛙蝌蚪性别分化、性腺发育的诱导作用。旨在讨论中国林蛙性别控制的最佳途径和最佳方法，以及性激素对蝌蚪生长发育的促进作用。结果发现：在蝌蚪饲料中添加不同剂量的性激素，制成性激素饲料。蝌蚪在摄食饲料的同时，性激素通过胃肠吸收进入蝌蚪体内，对蝌蚪性别分化具有诱导作用，效果十分明显。实验中三个雌激素饲料实验组雌性幼蛙比例均高于对照组，达到80％以上。实验组幼蛙的平均体重也高于对照组。因此采用在饲料中添加性激素的方法诱导蝌蚪性别分化、促进生长发育，控制林蛙性别是可行的。通过在蝌蚪饲料中添加适量的性激素诱导和控制林蛙的性别的实验证明：性激素饲料法和性激素溶液浸泡法都具有诱导和控制中国林蛙性别的作用。但性激素饲料法具有成本低廉、操作简单、容易在实际生产中应用的优点。

关键词：中国林蛙性激素性别诱导性别控制

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IκB激酶的结构及其三个亚基相关功能

生理科学进展 2009年第4期40卷 357-360页

作者：于佳佳霍洪亮东北师范大学生命科学学院长春130024

IκB激酶(IKK)在核因子κB(NF-κB)的活化过程中起着重要的催化调节作用。在以往的研究中,主要关注IKKβ催化亚基在NF-κB活化过程中的催化作用,对于IKKα催化亚基和调节亚基IKKγ/NEMO的了解甚少,但近几年的研究发现这三个亚基在NF-κ... 详细信息

IκB激酶(IKK)在核因子κB(NF-κB)的活化过程中起着重要的催化调节作用。在以往的研究中,主要关注IKKβ催化亚基在NF-κB活化过程中的催化作用,对于IKKα催化亚基和调节亚基IKKγ/NEMO的了解甚少,但近几年的研究发现这三个亚基在NF-κB的活化过程中发挥不同的作用。由于NF-κB与人体免疫、应激以及细胞凋亡等活动密切相关,因此研究启动NF-κB活化过程的关键酶是十分必要的,为临床治疗提供了一定的理论依据。本文简述IKKα、IKKβ和IKKγ/NEMO三个亚基的基本结构特征及其在NF-κB活化过程中的功能和一些其它的特殊调节作用。

关键词： IκB激酶核因子κB 磷酸化

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环境雌激素的微生物降解

微生物学报 2019年第3期59卷 442-453页

作者：田克俭孟繁星霍洪亮东北师范大学环境学院吉林长春130117 吉林省水污染控制与资源化工程实验室吉林长春130117

雌激素作为环境内分泌干扰物的一类重要物质,生物降解法是最为经济、最为绿色和最为适用的去除方法。通过分析雌激素的主要来源和危害、国内外雌激素降解菌的筛选与鉴定、类固醇雌激素降解酶的表达与检测、雌激素降解菌的基因组学特征... 详细信息

雌激素作为环境内分泌干扰物的一类重要物质,生物降解法是最为经济、最为绿色和最为适用的去除方法。通过分析雌激素的主要来源和危害、国内外雌激素降解菌的筛选与鉴定、类固醇雌激素降解酶的表达与检测、雌激素降解菌的基因组学特征以及雌激素的降解途径和机制,进一步阐述了雌激素生物降解的研究现状与进展,对未来的研究工作作出了展望。

关键词：雌激素降解菌降解酶生物降解机制

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中国林蛙人工养殖技术要点

淡水渔业 2002年第2期32卷 30-31页

作者：霍洪亮李东风东北师范大学生命科学学院长春130024

中国林蛙在人工环境下进行饲养,与林区野外封沟养殖和生态围栏养殖有着显著的区别.中国林蛙人工养殖需要有较大的成本投入和高质量管理水平.就中国林蛙人工养殖的一些关键问题,我们进行了探索性试验,并取得了一些宝贵的资料.

关键词：中国林蛙人工养殖品种选择蛙卵孵化蝌蚪培育幼蛙饲养成蛙管理性别控制

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雌激素与基质金属蛋白酶(MMPs)

基础医学与临床 2013年第8期33卷 1059-1062页

作者：王建军霍洪亮东北师范大学生命科学学院吉林长春130024

雌激素对基质金属蛋白酶的影响十分复杂,不同的组织细胞中在不同的环境下,对不同基质金属蛋白酶的作用有抑制和活化两方面效应。另外,雌激素对基质金属蛋白酶的影响还分别体现在信使RNA、蛋白的表达和活化等不同层次。

关键词：雌激素基质金属蛋白酶抑制活化

20-羟二十烷四烯酸在机体生理及病理调节中的作用

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生理科学进展 2007年第2期38卷 120-124页

作者：张迪霍洪亮张英妮曾庆华东北师范大学生命科学学院生理研究室长春130024

20多年前,国外学者就报道了机体内某些组织中存在着细胞色素P-450(cytochrome P-450,CYP)。已经证实它能催化花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的ω-羟基生成20-羟二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE)。随着研究的不断深入,人们逐渐发现作为第二信使,20-HETE在调节血管平滑肌紧张度、肾功能、脑血流量和肺血管舒张过程中发挥了重要作用;外源性的20-HETE对心脏冠脉循环也有明显的调节作用;并且它与高血压和妊娠毒血症等疾病的发生和发展关系密切。但国内对于20-HETE的相关研究还鲜有报道,本文将主要就20-HETE在机体生理及病理调节中的作用作一综述。

关键词： 20-HETE 花生四烯酸细胞色素P-450 第二信使

内脂素对心肌细胞ICAM-1和VCAM-1及相关因子的影响

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东北师大学报（自然科学版） 2013年第1期45卷 113-116页

作者：李文蕾孙丽丽霍洪亮东北师范大学生命科学学院吉林长春130024

为阐明内脂素(Visfatin)在心肌细胞炎性反应中对黏附分子ICAM-1和VCAM-1表达的影响及分子机制,利用原代培养心肌细胞在脂多糖(LPS)刺激发生炎性反应的基础上,检测了Visfatin对ICAM-1和VCAM-1表达的影响,并进一步检测了Visfatin对NF-κB... 详细信息

为阐明内脂素(Visfatin)在心肌细胞炎性反应中对黏附分子ICAM-1和VCAM-1表达的影响及分子机制,利用原代培养心肌细胞在脂多糖(LPS)刺激发生炎性反应的基础上,检测了Visfatin对ICAM-1和VCAM-1表达的影响,并进一步检测了Visfatin对NF-κB以及NF-κB抑制蛋白I-κB及磷酸化的影响.结果表明:Visfatin对LPS诱导的原代心肌细胞炎性因子ICAM-1和VCAM-1的表达具有显著的促进作用,而这一过程是通过促进I-κB的磷酸化,增加NF-κB p65的核转移,启动下游的黏附分子mRNA转录和蛋白的表达实现的.

关键词：内脂素心肌细胞黏附分子

雌二醇降解菌Acinetobacter ***1的筛选及降解条件优化

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环境科学与技术 2019年第1期42卷 94-100页

作者：靳申宝马喆田克俭霍洪亮东北师范大学环境学院吉林省污水生物处理与资源化重点实验室吉林长春130117

筛选并鉴定出1株雌激素降解菌Acinetobacter sp.命名为DS1,对DS1降解17β-雌二醇实验条件进行优化,使用响应面法(RSM)对降解过程中底物浓度、接种量、培养温度和p H值进行了分析,构建响应面模型,并对反应条件进行优化。优化最佳降解条件... 详细信息

筛选并鉴定出1株雌激素降解菌Acinetobacter sp.命名为DS1,对DS1降解17β-雌二醇实验条件进行优化,使用响应面法(RSM)对降解过程中底物浓度、接种量、培养温度和p H值进行了分析,构建响应面模型,并对反应条件进行优化。优化最佳降解条件为:17β-雌二醇量5.10 mg/L;接种量7.5%;p H值8.7;温度27℃。并进行试验验证,结果接近,响应面模型可有效描述降解过程,为降解工程应用和设计提供技术参考。

关键词：不动杆菌 17β-雌二醇降解 RSM优化