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IFN-α诱导HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G的表达

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第1期27卷 61-64页

作者：雷延昌王宝菊田拥军张正茂郝友华杨东亮华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室武汉430030

目的了解IFN-α对HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G表达的影响及其机制。方法HuH7细胞给予不同浓度的IFN-α（0u／ml、100u／ml、400u／ml、800u／ml and 1200u／ml）刺激，10h后提取细胞总RNA，RT-PCR和实时定量RT-PCR检测HuH7细胞内APOBE... 详细信息

目的了解IFN-α对HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G表达的影响及其机制。方法HuH7细胞给予不同浓度的IFN-α（0u／ml、100u／ml、400u／ml、800u／ml and 1200u／ml）刺激，10h后提取细胞总RNA，RT-PCR和实时定量RT-PCR检测HuH7细胞内APOBEC3G的mRNA水平变化，Western blot分析APOBEC3G蛋白水平的表达；分别构建不同长度的含有IRF-E（IFN regulatory factor element）位点的APOBEC3G起始密码上游序列报告质粒、不含IRF-E和IRF-E位点突变的虫荧光素酶报告质粒，报告基因分析IFN-α刺激后APOBEC3G起始密码上游IRF-E位点对APOBEC3G表达的影响。结果IFN-α上调HuH7细胞APOBEC3G mRNA和蛋白水平的表达，并具有剂量依赖的效应。序列分析发现APOBEC3G起始密码上游的-298～-283和-57～-47位碱基分别存在IRF-E和ISRE（IFN stimulated response element）序列。报告基因分析结果显示，干扰素使含有IRF-E序列的APOBEC3G启动子报告质粒的虫荧光素酶的活性增加6～8倍，而不含IRF-E序列和IRF-E位点突变的报告质粒的虫荧光素酶活性在干扰素刺激后几乎没有变化。结论IFN-α可通过IRF-E位点上调APOBEC3GmRNA和蛋白水平的表达，从而发挥抗病毒效应。

关键词： APOBEC3G IFN-α 肝细胞 IRF-E

慢性重症乙型病毒性肝炎2家系HLA-DRB1~* 1301(2)基因的遗传传递

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郑州大学学报（医学版） 2007年第4期42卷 669-672页

作者：余祖江雷延昌江河清梁红霞李志勤郑州大学第一附属医院感染科郑州450052 华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫室武汉430030

目的:探讨影响重症乙型肝炎发生的宿主遗传背景因素,分析慢性重症乙型肝炎发生的基本规律,为慢性乙型肝炎患者的早期预防和诊断提供理论基础。方法:选择2例重症乙型肝炎患者,对其家系进行调查,并对家系成员进行HLA-DRB1* 1301(2)基因检... 详细信息

目的:探讨影响重症乙型肝炎发生的宿主遗传背景因素,分析慢性重症乙型肝炎发生的基本规律,为慢性乙型肝炎患者的早期预防和诊断提供理论基础。方法:选择2例重症乙型肝炎患者,对其家系进行调查,并对家系成员进行HLA-DRB1* 1301(2)基因检测和HBV DNA全基因组克隆分析。结果:HLA-DRB1*1301(2)基因在子代传递过程中,其中1例重症乙型肝炎患者亲代和子1代均未发生重症肝炎;另1例重症乙型肝炎患者,亲代和子1代均有病毒持续存在。HBV DNA全基因组测序分析未见特殊变异。结论:在重症乙型肝炎发生中,除乙型肝炎病毒变异因素外,HLA-DRB1* 1301(2)等位基因可能起到重要作用,宿主多基因因素也可能参与了慢性乙型肝炎重症化的发生。

关键词：重症乙型病毒性肝炎家系 HLA-DRB1* 1301(2)基因乙型肝炎病毒

载脂蛋白质B mRNA编辑酶催化多肽3G抑制乙型肝炎病毒和鸭乙型肝炎病毒复制

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中华肝脏病杂志 2006年第10期14卷 738-741页

作者：雷延昌马涛郝友华张正茂田拥军王宝菊杨东亮华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室武汉430030

目的了解载脂蛋白质B mRNA编辑酶催化多肽3G(APOBEC3G)对乙型肝炎病毒(HBV)和鸭乙型肝炎炎病毒(DHBV)复制的抑制作用。方法从健康人外周血单个核细胞提取RNA,逆转录聚合酶链反应扩增APOBEC3G,将产物克隆到pXF3H载体的EcoRⅠ和HindⅢ酶... 详细信息

目的了解载脂蛋白质B mRNA编辑酶催化多肽3G(APOBEC3G)对乙型肝炎病毒(HBV)和鸭乙型肝炎炎病毒(DHBV)复制的抑制作用。方法从健康人外周血单个核细胞提取RNA,逆转录聚合酶链反应扩增APOBEC3G,将产物克隆到pXF3H载体的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点以构建真核表达质粒；以ayw亚型HBV全长质粒构建具有复制能力的1．3倍HBV质粒(pHBV1．3)。不同剂量的APOBEC3G真核表达质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞；酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液的乙型肝炎表面抗原和e抗原水平,Southern blot和Northem blot分析HBV核衣壳相关DNA和RNA的水平变化。不同剂量APOBEC3G真核表达质粒与头尾相接的2倍DHBV质粒共转染LMH鸡肝癌细胞,Southern blot分析DHBV核衣壳相关DNA水平变化。结果成功构建APOBEC3G真核表达质粒和具有复制能力的1．3倍HBV质粒。APOBEC3G抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原的分泌,转染细胞内HBV核衣壳相关RNA表达水平下降,而对核心蛋白质的表达没有影响；APOBEC3G对转染细胞内HBV和DHBV核衣壳相关DNA水平具有剂量依赖的抑制效应。结论APOBEC3G对HBV和DHBV复制具有抑制作用。

关键词：肝炎病毒,乙型肝炎病毒,鸭载脂蛋白质B mRNA编辑酶催化多肽3G

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重型肝炎合并胃肠功能衰竭72例临床分析

中国现代医学杂志 2013年第2期23卷 92-96页

作者：杨玲玲何金秋雷延昌杨文龙南昌大学附属感染病医院(南昌市第九医院)肝一科江西南昌330002 南昌大学附属感染病医院(南昌市第九医院)肝衰竭实验室江西南昌330002

目的分析并发于重型肝炎的胃肠功能衰竭对其预后的影响。方法对207例重型肝炎病例进行回顾性分析,其中合并胃肠功能衰竭72例,为肝性胃肠功能衰竭(hepatic gastrointestinal failure,HGIF)组,即HGIF组;余135例为非HGIF组。结果 HGIF组72... 详细信息

目的分析并发于重型肝炎的胃肠功能衰竭对其预后的影响。方法对207例重型肝炎病例进行回顾性分析,其中合并胃肠功能衰竭72例,为肝性胃肠功能衰竭(hepatic gastrointestinal failure,HGIF)组,即HGIF组;余135例为非HGIF组。结果 HGIF组72例患者入院经治疗后黄疸加深迅速、凝血功能差,总胆红素(TBIL)(478.01±111.77)μmol/L,高于非HGIF组(68.40±21.92)μmol/L;凝血酶原活动度(PTA)(23.18±9.75)%,低于非HGIF组(102.89±15.76)%,两组对比差异有统计学意义(P<0.05,)。其中HGIF组并发腹膜炎56例(77.78%),肝性脑病31例(43.06%),27例(37.50%)死亡。而非HGIF组并发腹膜炎30例(22.22%),肝性脑病15例(11.11%),仅12例(8.89%)死亡,两组并发症几率及生存率对比差异有统计学意义(P<0.05)。结论合并胃肠功能衰竭的重型肝炎组出现腹膜炎、肝性脑病、水电解质紊乱等并发症几率大,死亡率高,可为重型肝炎预后判断提供一定依据。

关键词：重型肝炎肝性胃肠功能衰竭预后

金黄色葡萄球菌的耐药性及其耐氟喹诺酮机制的研究

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中华内科杂志 2001年第3期40卷 176-179页

作者：雷延昌桂希恩冯国琴湖北医科大学第二附属医院感染科武汉430071 湖北医科大学第二附属医院检验科武汉430071

目的　了解金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )的耐药性及其耐氟喹诺酮的机制。方法　用纸片扩散法测定 2 0 0株金葡菌对 12种抗生素的耐药性 ,琼脂稀释法测定 5 2株耐环丙沙星金葡菌对 3种氟喹诺酮的最低抑菌浓度 (MIC)。聚合酶链反应限制性长... 详细信息

目的　了解金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )的耐药性及其耐氟喹诺酮的机制。方法　用纸片扩散法测定 2 0 0株金葡菌对 12种抗生素的耐药性 ,琼脂稀释法测定 5 2株耐环丙沙星金葡菌对 3种氟喹诺酮的最低抑菌浓度 (MIC)。聚合酶链反应限制性长度多态性分析及利血平逆转实验分别检测耐环丙沙星金葡菌gyrA和grlA基因突变及norA基因表达。结果　耐甲氧西林金葡菌 (MRSA)占 34 % ,并对多种抗菌药物耐药 ,但对万古霉素均敏感。MRSA对环丙沙星的耐药率高达 79 4% ,且对其他氟喹诺酮交叉耐药。 5 2株耐环丙沙星金葡菌中 42株 (80 8% )检出gyrA基因 84位点突变 ,grlA基因 80位点和 84位点突变分别有 10株 (19 2 % )和 14株 (2 6 9% ) ,gyrA或双基因突变株对环丙沙星的MIC显著高于单独grlA突变株或不存在gyrA 84位点突变株 (P <0 0 1)。利血平逆转后 5 2株耐药菌对 3种氟喹诺酮的MIC显著降低 (P <0 0 1)。结论　金葡菌的耐药性日趋严重 ,特别是MRSA仅对万古霉素等少数抗菌药物敏感 ,目前氟喹诺酮不适宜治疗MRSA ;临床分离金葡菌耐氟喹诺酮的机制大多涉及药物作用靶位gyrA和grlA的基因突变以及主动外排泵增强。

关键词：金黄色葡萄球菌耐药性氟喹诺酮抗生素纸片扩散法测定

HCV核心蛋白抑制干扰素α诱导的抗病毒基因表达及其机制研究

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生物工程学报 2007年第6期23卷 1000-1004页

作者：常燕子雷延昌郝友华陈珊珊吴雯杨东亮陆蒙吉华中科技大学同济医学院病原生物系武汉430030 华中科技大学附属同济医院临床免疫室武汉430030

研究HCV核心蛋白对干扰素α诱导的抗病毒分子PKR和2′-5′OAS表达的影响及其机制。HCV核心蛋白表达质粒转染HepG2细胞,RT-PCR分析PKR和2′-5′OAS的mRNA水平变化,荧光素酶活性分析核心蛋白对ISRE介导的基因表达的影响;Western-blot分析S... 详细信息

研究HCV核心蛋白对干扰素α诱导的抗病毒分子PKR和2′-5′OAS表达的影响及其机制。HCV核心蛋白表达质粒转染HepG2细胞,RT-PCR分析PKR和2′-5′OAS的mRNA水平变化,荧光素酶活性分析核心蛋白对ISRE介导的基因表达的影响;Western-blot分析SOCS3、STAT1及STAT1磷酸化水平的变化。在干扰素α刺激情况下,表达HCV核心蛋白的细胞中,PKR和2′-5′OAS的mRNA水平下降,ISRE介导的荧光素酶活性降低,STAT1磷酸化水平下降。此外,核心蛋白表达的细胞中SOCS3的mRNA和蛋白水平明显升高。结果表明,HCV核心蛋白可能通过激活SOCS3、抑制STAT1的磷酸化,从而下调干扰素α诱导的PKR和2′-5′OAS表达。

关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白干扰素α STAT1 SOCS3

人工构建含丙型肝炎病毒核糖体插入位点的双顺反子表达载体

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世界华人消化杂志 2003年第10期11卷 1520-1523页

作者：阚全程余祖江雷延昌杨东亮郝连杰华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室湖北省武汉市430030 郑州大学第一附属医院感染科河南省郑州市450052

目的:研究丙型肝炎病毒核糖体插入位点启动翻译蛋白质功能,构建双顺反子真核表达载体.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎基因组中核糖体插入位点序列(IRES),定向克隆到pcDNA3-S质粒多克隆酶切位点中。在IRES下游克隆乙型肝炎病毒核心... 详细信息

目的:研究丙型肝炎病毒核糖体插入位点启动翻译蛋白质功能,构建双顺反子真核表达载体.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎基因组中核糖体插入位点序列(IRES),定向克隆到pcDNA3-S质粒多克隆酶切位点中。在IRES下游克隆乙型肝炎病毒核心基因,测序鉴定后获得的质粒经脂质体转染hepG2细胞,间接免疫荧光染色和Western-blot检测.结果:在间接免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见已型肝炎病毒S基因和核心基因表达。转染细胞破碎后免疫沉淀检测和图像分析表明,两种基因有相似的表达量。结论:人为截断HCV 5’NTR区17个碱基,并不影响IRES对下游基因蛋白质翻译,为成功构建了含丙型肝炎病毒IRES的双顺反子表达载体打下基础。

关键词：丙型肝炎病毒核糖体插入位点双顺反子表达载体 RT-PCR 定向克隆病毒复制

慢性乙型肝炎病毒清除自杀基因平衡制约载体系统的构建

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世界华人消化杂志 2003年第10期11卷 1515-1519页

目的:建立清除乙型肝炎病毒(HBV)自杀基因平衡制约载体系统,靶向清除HBV感染的肝细胞,抑制慢性乙型肝炎和肝硬化患者免疫再括动。方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎病毒(HCV)基因组中核糖体插入位点(IRES),以pcDNA3载体为基础,构建双... 详细信息

目的:建立清除乙型肝炎病毒(HBV)自杀基因平衡制约载体系统,靶向清除HBV感染的肝细胞,抑制慢性乙型肝炎和肝硬化患者免疫再括动。方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎病毒(HCV)基因组中核糖体插入位点(IRES),以pcDNA3载体为基础,构建双顺反子表达载体,同时在IRES位点的上游克隆HBV表面基因的部分反义序列和HCV全长核心基因,在IRES位点下游克隆胸腺苷激酶基因,PCR、酶切和测序鉴定。构建的清除乙型肝炎病毒(HBV)自杀基因平衡制约载体系统分别转染培养基含有更昔洛韦的HepG2细胞和2.2.15细胞。结果:构建的清除乙型肝炎病毒(HBV)自杀基因平衡制约载体系统可以选择性促使2.215细胞凋亡(实验组细胞凋亡率为15％,而对照组仅为6％);抑制2.2.15细胞在培养基中分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),统计学分析表明,HBsAg在培养基中检测滴度,在两组之间有显著性差异(P<0.05).结论:构建以HBV表面基因为靶基因,自杀基因为效应基因的自杀基因制约平衡系统,可能为下一步慢性乙型肝炎的基因治疗提供理想的基因治疗载体。

关键词：慢性乙型肝炎自杀基因载体系统乙型肝炎病毒免疫再活动基因治疗 RT-PCR

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鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达

中国公共卫生 2007年第5期23卷 562-564页

作者：胡权张正茂张小勇张振华雷延昌周敦金黄建国杨东亮湖北省武汉市疾病预防控制中心 430022 华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室

目的构建鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染性克隆,通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法以湖北麻鸭DHBV分离株(DQ276978)为模板,用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒(pMD-DHBV)和DHBV阳性血清中获取3部分基因片... 详细信息

目的构建鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染性克隆,通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法以湖北麻鸭DHBV分离株(DQ276978)为模板,用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒(pMD-DHBV)和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段,总长4.4 kb,克隆至载体PCR2.1的SacI和NotI酶切位点,构建含1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒,并酶切鉴定其插入方向。将构建的重组质粒经脂质体Lipo-fectineTM 2000导入鸡肝癌细胞系(LMH)细胞中转染表达,收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定,证实成功获得正向插入的1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot检测表明,该重组质粒在LMH细胞内存在各种病毒复制中间体;通过电镜观察,转染细胞上清液中存在DHBV完整病毒颗粒。结论经体外重组,构建出携带1.5倍加长DHBV基因组片段的重组质粒PCR2.1-DHBV1.5,并可在鸡肝癌细胞LMH中介导高水平病毒复制,从而获得含可自我复制病毒颗粒的转染细胞上清液作为动物体内感染接种物。

关键词：鸭乙型肝炎病毒 1.5倍DHBV基因组鸡肝癌细胞系(LMH) 基因表达