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马铃薯卷叶病毒与S病毒重组双CP多克隆抗体的制备

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华北农学报 2022年第4期37卷 212-219页

作者：吉祥宋志成韦晓玲杨煜隋炯明郭宝太青岛农业大学农学院山东省旱作农业技术重点实验室山东青岛266109 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所山东济南250100

为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测,构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP... 详细信息

为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测,构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)并提取菌体蛋白,用镍离子亲和层析纯化获得了分子质量为51.2 ku的高纯度的重组双CP。用该重组双CP作抗原免疫家兔获得了高效价(1∶128 k)抗血清。纯化的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性标准物特异性结合,与另外4种马铃薯主要病毒(PVX、PVY、PVA与PVM)无交叉反应。间接ELISA反应中,稀释度为1∶3200的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性物都呈现阳性反应;在DAS-ELISA反应中,稀释度均为1∶100的重组双CP多克隆抗体及其碱性磷酸酶标记物与PLRV或PVS的阳性标准物也分别呈现阳性反应。结果表明,制备的重组双CP抗体既可用于PLRV与PVS这2种病毒的间接ELISA检测,也可用于DAS-ELISA检测。

关键词：马铃薯卷叶病毒 S病毒重组双CP 多克隆抗体间接ELISA DAS-ELISA

花生小GTP结合蛋白基因AhRabG3f启动子的盐胁迫响应元件分析

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生物工程学报 2022年第8期38卷 2989-2998页

作者：杜国宁相杰林顺钰孔祥远武秀玲管学东朱虹王晶珊乔利仙隋炯明赵春梅青岛农业大学农学院山东省花生产业协同创新中心山东省旱作重点实验室山东青岛266109 诸城市农业农村局山东诸城262200 青岛农业大学生命科学学院山东青岛266109

为研究花生小GTP结合蛋白基因AhRabG3f对盐胁迫响应的分子机制,文中克隆了花生AhRabG3f基因起始密码子上游1914 bp的启动子片段(3f-P)。将该启动子5'末端截短获得5个片段(3f-P1-3f-P5),长度分别为1729、1379、666、510、179 bp。构建了... 详细信息

为研究花生小GTP结合蛋白基因AhRabG3f对盐胁迫响应的分子机制,文中克隆了花生AhRabG3f基因起始密码子上游1914 bp的启动子片段(3f-P)。将该启动子5'末端截短获得5个片段(3f-P1-3f-P5),长度分别为1729、1379、666、510、179 bp。构建了将这6个启动子片段与gus基因融合的植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS表达分析和酶活性检测,结果表明,在转入各启动子片段的烟草中,都能检测到gus基因的表达,其中全长启动子3f-P的驱动活性最弱,而截短片段3f-P3的驱动活性最强。对转基因烟草进行盐胁迫处理后,3f-P、3f-P1、3f-P2和3f-P3所驱动GUS酶活性是未经盐诱导的3.3、1.2、1.9、1.2倍,表明AhRabG3f启动子是盐诱导型的,在3f-P至3f-P3之间可能存在对盐响应的正调控元件。通过对盐胁迫处理后各启动子片段驱动的GUS活性分析,推测在AhRabG3f启动子上游1930–1745 bp、682–526 bp之间存在可能对盐响应的正调控元件MYB、GT1和富含TC的重复序列,1395–682 bp之间存在可能对盐响应的负调控元件MYC。研究结果可为利用诱导型启动子调控花生的耐盐性提供指导。

关键词：花生小GTP结合蛋白启动子盐胁迫响应元件

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花生Rab2基因的克隆及表达分析

中国农学通报 2012年第27期28卷 37-44页

作者：李瑞隋炯明青岛农业大学生命科学学院/山东省高校植物生物技术重点实验室山东青岛266109

Rab2是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白从内质网到高尔基体的运输,研究发现有些Rab2基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得花生Rab2基因,本试验根据拼接的cDNA序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR克隆了1个花生Rab2基因。测序结... 详细信息

Rab2是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白从内质网到高尔基体的运输,研究发现有些Rab2基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得花生Rab2基因,本试验根据拼接的cDNA序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR克隆了1个花生Rab2基因。测序结果显示其cDNA含有长636bp的完整开放阅读框,编码的蛋白含211个氨基酸,推测分子量为23.4kDa。比对分析发现花生Rab2蛋白与多种生物的Rab2的氨基酸序列具有较高的同源性,荧光定量PCR研究表明AhRab2基因受低温、干旱、盐和植物激素ABA的诱导表达。这为利用基因工程手段调控花生的抗逆性奠定了基础。

关键词：花生 Rab2基因进化树表达分析

以木糖异构酶基因作为选择标记的花生遗传转化

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核农学报 2012年第3期26卷 444-448,483页

作者：丁霄隋炯明王晶珊乔利仙青岛农业大学生命科学学院/山东省高校植物生物技术重点实验室山东青岛266109

用木糖异构酶基因xylA替换掉pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin-B-phosphotransferase,Hpt),构建了植物表达载体pCAMBIA1301-xylA。再利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-xylA导入花生,转移到添加蔗糖(5g/L)和不同浓度木糖(5,10,20,30g/L)的体胚诱导及体胚萌发培养基上培养。对外植体成苗率及转基因阳性率进行统计,结果表明,当木糖浓度为10g/L时,诱导成苗率为15.25%,再生植株生长健壮,且转基因阳性率高达77.27%,最终确定10g/L为最适木糖筛选浓度。该筛选方法利用木糖作为筛选剂,可以避免利用抗生素筛选可能造成的安全隐患,转化效率高,是一种安全、高效的筛选方法。

关键词：花生木糖异构酶基因农杆菌介导法遗传转化

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花生fw2.2基因的克隆及遗传转化

核农学报 2011年第6期25卷 1123-1128,1210页

作者：刘强王晶珊乔利仙赵春梅隋炯明青岛农业大学生命科学学院青岛市主要农作物创新与应用重点实验室山东青岛266109

fw2.2基因是影响番茄果重的一个重要数量性状基因,在心皮的细胞分裂中起负调控作用。本研究以番茄fw2.2基因的序列为探针,从花生EST数据库中筛选同源序列。根据花生的EST拼接序列设计引物对花生进行扩增,目标产物测序后,将推测的氨基酸... 详细信息

fw2.2基因是影响番茄果重的一个重要数量性状基因,在心皮的细胞分裂中起负调控作用。本研究以番茄fw2.2基因的序列为探针,从花生EST数据库中筛选同源序列。根据花生的EST拼接序列设计引物对花生进行扩增,目标产物测序后,将推测的氨基酸序列与其他植物fw2.2基因编码的氨基酸序列进行比对,同源性为34.78%～66.85%。半定量RT-PCR结果表明,该基因在野生种和栽培种中的表达存在差异。将fw2.2基因连接到植物表达载体,通过农杆菌介导法转化花生品种花育23号,获得了12个PCR阳性的独立转化子。

关键词：花生 fw2.2基因克隆转化

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花生萌发期耐盐性鉴定及耐盐种质筛选

花生学报 2022年第4期51卷 35-43页

作者：李晓婷胡畅丽李鑫朱虹隋炯明王晶珊乔利仙唐艳艳青岛农业大学农学院山东青岛266109

为加强黄河三角洲盐碱地的开发利用,扩大花生种植面积,提高花生产量,本研究以17份花生品种(系)为材料,利用水培方法,测定不同盐浓度下萌发期发芽率。确定0.7%NaCl浓度作为花生品种萌发期耐盐性鉴定的最适浓度,共筛选出5个耐盐品种(系)... 详细信息

为加强黄河三角洲盐碱地的开发利用,扩大花生种植面积,提高花生产量,本研究以17份花生品种(系)为材料,利用水培方法,测定不同盐浓度下萌发期发芽率。确定0.7%NaCl浓度作为花生品种萌发期耐盐性鉴定的最适浓度,共筛选出5个耐盐品种(系)。在山东平度非盐碱地和东营盐碱地分别种植5个耐盐和4个非耐盐品种(系),测定产量性状相关指标。结果表明,盐碱胁迫显著降低花生发芽率,明显抑制花生的生长发育和产量。高油酸品种宇花18号表现出较强的耐盐碱性,其次是化学诱变突变体品系ST24-1、ST24-8和ST24-11,均适于盐碱地种植,为耐盐碱花生品种的选育提供了新材料。本研究表明,萌发期耐盐性的鉴定可作为花生耐盐碱鉴定的基础指标之一。

关键词：盐碱地花生种质萌发期耐盐产量性状

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备

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园艺学报 2012年第10期39卷 1949-1957页

作者：隋炯明何心凤郭真李广存王晶珊郭宝太青岛农业大学生命科学学院山东省植物生物技术高校重点实验室山东青岛266109 山东省农业科学院蔬菜研究所济南250100

利用RT-PCR扩增马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白(CP)基因(PLRV-CP),回收大小约630bp的特异性扩增片段并进行T-A克隆,测序表明该基因长度为627bp,与已报道的36个PLRV-CP基因的核苷酸序列的同源性大于96%。以pBAD/Thio-TOPO为起始载体,构建... 详细信息

利用RT-PCR扩增马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白(CP)基因(PLRV-CP),回收大小约630bp的特异性扩增片段并进行T-A克隆,测序表明该基因长度为627bp,与已报道的36个PLRV-CP基因的核苷酸序列的同源性大于96%。以pBAD/Thio-TOPO为起始载体,构建了PLRV-CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP。以pBAD-LRCP为模板,用PCR法删除了该基因富含精氨酸稀有密码子的第52～177核苷酸,获得了PLRV缺失突变CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126。用阿拉伯糖诱导工程菌TOP10(pBAD-LRCP-126),获得了34kD的诱导表达的融合蛋白(重组CP)。用镍离子亲和层析法从包涵体中纯化出了高纯度的重组CP,用纯化的重组CP作抗原免疫家兔获得了PLRV特异性的抗血清,间接ELISA检测显示效价为1︰12800。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备PLRV抗血清奠定了基础。

关键词：马铃薯卷叶病毒 CP基因缺失突变原核表达抗血清

花生AhRab7基因的克隆及其原核表达研究

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植物遗传资源学报 2013年第4期14卷 686-693页

作者：向小华宋琳裴玉贺郭新梅隋炯明宋希云青岛农业大学农学与植保学院/青岛市主要农作物种质资源创新与应用重点实验室青岛266109 青岛农业大学生命科学学院/植物生物技术重点实验室青岛266109

为了研究花生小G蛋白AhRab7基因在大肠杆菌中的表达模式及与高盐胁迫的关联性,采用RT-PCR技术从花生(Arachis hypogaea L.)品种花育20中克隆了AhRab7(7-1、7-2)的cDNA全长序列,通过核苷酸序列和氨基酸序列分析结果表明AhRab7(7-1、7-2)... 详细信息

为了研究花生小G蛋白AhRab7基因在大肠杆菌中的表达模式及与高盐胁迫的关联性,采用RT-PCR技术从花生(Arachis hypogaea L.)品种花育20中克隆了AhRab7(7-1、7-2)的cDNA全长序列,通过核苷酸序列和氨基酸序列分析结果表明AhRab7(7-1、7-2)的cDNA全长分别为872 bp、816 bp,分别含1个621 bp、618 bp大小的开放阅读框(ORF,open readingframe),拟编码氨基酸数分别为206aa、205aa。将携带完整的ORF序列连入表达载体pET-28a(+)中,经IPTG诱导后进行耐盐性测定,结果表明两种全长重组酶(分别含pET-28a-Rab7-1和pET-28a-Rab7-2的重组质粒)均具有正常酶活性,明显缓解了高盐环境(5.5%～10%NaCl溶液)对大肠杆菌的生长胁迫,而对照组(含空载体pET-28a)未能检测出相同的酶活性,结果表明AhRab7基因表达可以显著缓解高盐胁迫影响。目的基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小为23kDa,与预测结果一致。这为后期探讨花生对盐胁迫及其他非生物胁迫的研究奠定了一定的基础。

关键词：花生 Rab7基因克隆原核表达盐胁迫

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稻米淀粉粘滞性谱特征的表现及其遗传

中国水稻科学 2004年第5期18卷 384-390页

作者：李欣张蓉隋炯明梁国华沈新平严长杰顾世梁顾铭洪扬州大学农学院农学系江苏扬州225009

通过对水稻F2 无性系群体及大量品种 (系 )的RVA谱的测定 ,研究了稻米淀粉RVA谱的类型及遗传。结果表明 :(1)RVA谱可分为A～F六种类型 ,糯稻的特征图谱为A型 ,籼稻的特征图谱有B、C、D、E、F五种类型 ,粳稻有D、E、F三种类型。 (2 )稻... 详细信息

通过对水稻F2 无性系群体及大量品种 (系 )的RVA谱的测定 ,研究了稻米淀粉RVA谱的类型及遗传。结果表明 :(1)RVA谱可分为A～F六种类型 ,糯稻的特征图谱为A型 ,籼稻的特征图谱有B、C、D、E、F五种类型 ,粳稻有D、E、F三种类型。 (2 )稻米的表观直链淀粉含量 (AAC)不同 ,RVA谱则不同。稻米的AAC相同 ,RVA谱也可不同 ,在低、中AAC类型中 ,RVA谱的差异能反映品种食味品质的差异。(3) 4个杂交稻组合的RVA谱表现出相同的特点 ,除最高粘度和起浆温度外 ,其他特征值均介于双亲之间 ,表明杂交稻米品质改良要求不育系与恢复系的改良同步进行。 (4)在F2 无性系群体中 ,RVA谱各特征均呈连续分布 ,最高粘度是典型的数量性状遗传 ,热浆粘度、冷胶粘度、崩解值、消减值、回复值都可能是由一对主效基因和若干微效基因共同控制的遗传。

关键词：水稻稻米淀粉粘滞性食味品质遗传 RVA谱