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作者：陈迟迟苏州大学

学位级别：硕士

白细胞介素9（interleukin-9,IL-9）是一种T细胞生长因子,来源于TH2、TH9、TH17、调节性T细胞（Treg）等T辅助细胞亚群,但主要由辅助性T细胞（TH9）分泌。IL-9在超敏反应、自身免疫性疾病、抗寄生虫感染和肿瘤免疫等疾病发生发展中具有... 详细信息

白细胞介素9（interleukin-9,IL-9）是一种T细胞生长因子,来源于TH2、TH9、TH17、调节性T细胞（Treg）等T辅助细胞亚群,但主要由辅助性T细胞（TH9）分泌。IL-9在超敏反应、自身免疫性疾病、抗寄生虫感染和肿瘤免疫等疾病发生发展中具有重要作用,但IL-9对骨代谢的影响未见报道。有研究发现IL-9的缺失抑制了Ⅱ型先天性免疫细胞（ILC2）的增殖,同时抑制调节性T细胞（Treg）的激活,导致血清转移性关节炎（SIA）小鼠出现关节软骨过度破坏,加剧骨质丢失;而过表达IL-9后可以促进了 ILC2的增殖和Treg细胞的激活,减轻了炎症反应,同时减少了骨量丢失。本研究旨在探讨IL-9缺失后对小鼠骨量变化的影响,并对其机制进行初步探究,为寻找潜在的疾病干预靶点提供依据,为骨质破坏相关疾病的诊疗提供新的思路和策略,具有重要的科学意义和临床价值。目的:探究IL-9对骨代谢的影响及其机制。方法:收集不同年龄阶段的（2月龄、3月龄、6月龄、12月龄和18月龄）野生型小鼠（WT）和IL-9敲基因小鼠（IL-9-/-）血清、脾脏和骨组织。micro-CT扫描股骨分析相关骨量参数。ELISA检测血清中骨钙素（OC/BGP）和Ⅰ型胶原交联羧基端肽（CTX）的含量。流式细胞术分析脾脏中的免疫细胞和骨髓中的免疫细胞、成骨前体细胞、破骨前体细胞比例。组织形态学染色观察骨髓腔中骨量情况。钙黄绿素双标实验检测动态骨形成情况。酸银法钙盐染色（Von Kossa）实验检测骨矿化能力。克隆形成单位（Colony-Forming Units,CFU-F）染色、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymal stem cells,BMMSCs）的数量及成骨分化情况。分离WT小鼠和IL-9-/-小鼠全骨髓细胞培养BMMSCs,传代后流式检测干细胞表型后备用。CCK8检测BMMSCs的增殖情况。BMMSCs经成骨诱导7天进行ALP染色和实时荧光定量 PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测成骨相关基因。BMMSCs经成骨诱导14天进行茜素红染色。BMMSCs经成骨诱导3天Western blot检测JAK/STAT信号通路和成骨相关蛋白表达。分离WT小鼠和IL-9-/-小鼠全骨髓细胞培养骨髓来源的单核/巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophage,BMMs）,加入适量的 M-CSF 和 RANKL,qRT-PCR 检测BMMs破骨相关基因表达情况。TRAP染色和骨架染色检测BMMs破骨向分化情况。骨吸收实验检测BMMs骨吸收能力。结果:micro-CT分析显示,与WT小鼠相比,IL-9-/-小鼠骨形态相关参数显著降低。ELISA结果显示,与WT小鼠血清相比,IL-9-/-小鼠血清中OC/BGP含量显著降低,但是两者CTX含量没有明显差异。流式细胞术结果显示,与WT小鼠相比,IL-9-/-小鼠脾脏中Treg细胞显著降低,IL-9-/-小鼠骨髓中BMMSCs细胞比例显著升高,但是成骨前体细胞比例显著下降。股骨H＆E染色、Col1免疫组化、Masson染色和TRAP染色结果显示,与WT小鼠相比,IL-9-/-小鼠骨髓腔中骨小梁减少,Coll阳性细胞数目减少,胶原形成减少,TRAP阳性细胞数目也减少。钙黄绿素双标实验显示,与WT小鼠相比,IL-9-/-小鼠骨髓腔中的小梁骨数目显著较少,且骨形成速度较慢。von Kossa显示,与WT小鼠相比,IL-9-/-小鼠股骨中钙沉积颜色较浅;同时,IL-9-/-小鼠股骨中钙沉积阳性细胞数目也显著低于WT小鼠。CFU-F染色结果显示,与WT小鼠BMMSCs相比,IL-9-/-小鼠BMMSCs克隆数目较多,但其ALP阳性细胞和茜素红染色阳性细胞数量较少。WT小鼠和IL-9-/-小鼠BMMSC具有干细胞形态,CD29阳性表达率达到90%以上,CD34、CD45等表达率在10%左右。CCK-8检测其增殖没有明显差异。ALP染色和茜素红染色及量化结果表明IL-9-/-小鼠BMMSCs成骨能力减弱,而外源性加入IL-9可以改善IL-9-/-小鼠BMMSCs成骨能力。qRT-PCR结果显示IL-9-/-小鼠BMMSCs中成骨相关基因骨钙素（Osteocalcin OCN）、骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）、1型胶原（Recombinant Collagen Type Ⅰ,Col1）的表达能力较弱,同样加入IL-9以后可以促进其成骨能力。WB结果显示,与WT小鼠BMMSCs相比,IL-9-/-小鼠BMMSCs成骨相关

关键词： IL-9 骨量降低成骨细胞骨形成破骨细胞骨吸收

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白细胞介素9缺失抑制小鼠的成骨能力

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中国组织工程研究 2024年第26期28卷 4178-4183页

作者：王怡陈迟迟周熙超施勤苏州大学附属第一医院骨科苏州大学骨科研究所江苏省苏州市215006

背景:小鼠成骨能力受到JAK/STAT通路的调控,白细胞介素9能够通过JAK-STAT通路调控多种细胞的功能,有潜力成为调控成骨能力的新型细胞因子。目的:探究体内白细胞介素9的缺失对于小鼠成骨能力的影响。方法:将2月龄野生型小鼠(WT)和白细胞... 详细信息

背景:小鼠成骨能力受到JAK/STAT通路的调控,白细胞介素9能够通过JAK-STAT通路调控多种细胞的功能,有潜力成为调控成骨能力的新型细胞因子。目的:探究体内白细胞介素9的缺失对于小鼠成骨能力的影响。方法:将2月龄野生型小鼠(WT)和白细胞介素9基因全敲除小鼠(IL-9^(-/-))股骨进行Micro-CT扫描,分析其骨量变化;并分别对小鼠股骨切片行苏木精-伊红染色、Masson染色以及Ⅰ型胶原蛋白免疫组化染色。提取2月龄WT和IL-9^(-/-)小鼠骨髓细胞进行骨髓间充质干细胞克隆形成实验,并检测成骨基因的表达。为了进一步验证白细胞介素9是否通过JAK-STAT通路进行信号传导,采用Westernblot检测STAT3蛋白的表达。结果与结论:①Micro-CT扫描结果显示,相较于WT小鼠,IL-9^(-/-)小鼠的骨量显著降低,骨密度、骨体积分数、骨小梁数目显著降低,骨小梁分离度显著增大;②苏木精-伊红染色与Micro-CT结果一致,IL-9^(-/-)小鼠骨小梁密度更低;③Ⅰ型胶原蛋白免疫组化染色以及Masson染色结果显示,IL-9^(-/-)小鼠Ⅰ型胶原蛋白阳性成骨细胞数量显著减少,同时胶原形成能力更差;④克隆形成实验结果表明,IL-9^(-/-)小鼠成骨细胞的矿化能力显著低于WT小鼠;⑤Western blot结果显示,成骨诱导激活STAT3信号传导,WT成骨诱导组pSTAT3表达明显高于IL-9^(-/-)成骨诱导组,说明白细胞介素9通过JAK-STAT3通路调控成骨,白细胞介素9的缺失抑制成骨细胞的分化与功能,这可能是IL-9^(-/-)小鼠骨量降低的原因之一。

关键词：白细胞介素9 骨质疏松间充质干细胞成骨能力成骨诱导成骨矿化

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制备负载细胞可注射微球及体外评价

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中国组织工程研究 2022年第28期26卷 4483-4488页

作者：何家辰刘畅陈迟迟施勤苏州大学医学部苏州大学附属第一医院江苏省苏州市215006 苏州大学骨科研究所江苏省苏州市215006

背景:利用生物材料作为细胞载体能够提供3D培养微环境,支持细胞活力和功能,并有可能扩大细胞治疗的数量和治疗效果,因此寻找一个合适的生物材料显得十分重要。目的:制备可注射甲基丙烯酰化明胶多孔水凝胶微球,探究其生物相容性及负载细... 详细信息

背景:利用生物材料作为细胞载体能够提供3D培养微环境,支持细胞活力和功能,并有可能扩大细胞治疗的数量和治疗效果,因此寻找一个合适的生物材料显得十分重要。目的:制备可注射甲基丙烯酰化明胶多孔水凝胶微球,探究其生物相容性及负载细胞用于组织工程的潜力。方法:利用微流控技术制备可注射甲基丙烯酰化明胶多孔水凝胶微球,表征微球的微观形貌与硬度。分别采用正常培养基(对照组)与微球浸提液(实验组)培养MC3T3-E1细胞,利用CCK-8法检测细胞增殖,活死细胞染色法检测细胞存活。将微球与CD3^(+)T细胞共培养,以单独培养的CD3^(+)T细胞为对照,光学显微镜下观察微球是否对T细胞活化产生影响,Dapi染色观察微球负载T细胞的形态,流式细胞术验证与微球共培养是否对CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的比例产生影响。结果与结论:①倒置显微镜下可见,冻干前后的微球均保持高度分散且大小均一,直径大小满足可注射条件;扫描电镜下可见,冻干后的微球为多孔结构,孔隙均匀分布;微球的弹性模量为(9.76±2.04)kPa。②CCK-8检测与活死细胞染色显示,两组MC3T3-E1细胞的增殖趋势与增殖活性无明显差别。③光学显微镜下可见,培养2 d时微球未引起CD3^(+)T细胞的活化,也未干预CD3^(+)T细胞的活化,CD3^(+)T细胞分布于微球表面及孔隙内。④流式细胞术检测显示,微球未影响CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的比例。⑤结果表明,通过微流控技术制备了一种可注射甲基丙烯酰化明胶多孔微球,其具有良好的生物相容性且不会对细胞产生不利影响,是一种在组织工程中具有广阔应用前景的生物材料。

关键词：微流控水凝胶多孔微球可注射生物相容性,细胞疗法 T细胞组织工程

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肥胖小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

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中国组织工程研究 2022年第24期26卷 3846-3851页

作者：陈迟迟张雨何家辰施勤苏州大学医学部苏州大学附属第一医院骨科江苏省苏州市215123 苏州大学骨科研究所江苏省苏州市215006

背景:骨髓间充质干细胞分化受到多种因素的影响,肥胖小鼠骨髓间充质干细胞具有更佳的成骨分化能力。目的:探究正常饮食小鼠与高脂饮食诱导的肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的差异。方法:将4-6周龄Balb/c小鼠随机分为正常饮食组和高... 详细信息

背景:骨髓间充质干细胞分化受到多种因素的影响,肥胖小鼠骨髓间充质干细胞具有更佳的成骨分化能力。目的:探究正常饮食小鼠与高脂饮食诱导的肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的差异。方法:将4-6周龄Balb/c小鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组,饲养20周后,通过全骨髓培养法得到骨髓间充质干细胞,成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶染色以及qRT-PCR检测成骨相关基因的表达,成骨诱导14 d后进行茜素红染色。高脂饲养20周后,Micro-CT分析股骨骨量的变化,小鼠股骨切片进行苏木精-伊红染色。结果与结论:①与正常饮食组小鼠相比,高脂饮食饲养20周后小鼠体质量显著增加;②与正常饮食组小鼠骨髓间充质干细胞相比,高脂饮食组小鼠骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶阳性表达和钙结节数目显著增加,成骨相关基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白和RUNT相关转录因子2表达水平升高;③Micro-CT重建和骨形态参数量化结果显示,与正常饮食组小鼠相比,高脂饮食组小鼠骨量显著增加,其中骨密度、骨体积分数、骨面积与骨体积比值、骨小梁厚度和骨小梁数目均显著增加,而骨小梁分离度显著减小,苏木精-伊红染色显示高脂饮食组小鼠股骨内含有较多的骨小梁;④结果表明,肥胖小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强,进一步导致小鼠的骨密度、骨小梁厚度和骨小梁数目显著增加,骨量显著升高。

关键词：干细胞骨髓间充质干细胞正常饮食高脂饮食肥胖成骨诱导成骨分化小鼠

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绿原酸促进成骨前体细胞成骨分化的作用

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中国组织工程研究 2023年第14期27卷 2170-2175页

作者：朱灿何家恒陈迟迟刘波罗宗平孙杰施勤苏州大学附属第一医院骨科苏州大学骨科研究所苏州大学苏州医学院江苏省苏州市215123

背景:绿原酸是干李子中含量最丰富的多酚类物质,作为一种食源性药物有望用于骨质疏松治疗之中。目的:探究绿原酸对成骨前体细胞成骨分化的影响及其机制,并在骨质疏松小鼠模型中进行相关验证。方法:(1)体外实验:以含不同质量浓度(0,0.1,1... 详细信息

背景:绿原酸是干李子中含量最丰富的多酚类物质,作为一种食源性药物有望用于骨质疏松治疗之中。目的:探究绿原酸对成骨前体细胞成骨分化的影响及其机制,并在骨质疏松小鼠模型中进行相关验证。方法:(1)体外实验:以含不同质量浓度(0,0.1,1,10,100 mg/L)绿原酸的培养基培养MC3T3-E1细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖。采用含0,10,20 mg/L绿原酸的成骨诱导培养基培养MC3T3-E1细胞,进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、成骨基因表达与BMP-2/RUNX2/SMAD4信号通路蛋白检测。(2)体内实验:将32只雌性C57BL/6小鼠随机分成4组,假手术组、去卵巢组及低、高剂量绿原酸组,每组8只,低、高剂量绿原酸组去卵巢后腹腔注射25,50 mg/(kg·d)的绿原酸,连续给药8周。给药8周后,进行骨组织Micro-CT扫描与组织形态学观察。结果与结论:(1)体外实验:当绿原酸质量浓度≤10 mg/L时,对MC3T3-E1细胞的增殖无明显影响。碱性磷酸酶染色与茜素红染色显示,随着绿原酸质量浓度的增加,MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性、钙沉积和钙结节生成能力提高,成骨相关基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨钙素、骨形态发生蛋白2、RUNX2、SMAD4表达升高,骨形态发生蛋白2、RUNX2、SMAD4蛋白表达升高。(2)体内实验:Micro-CT扫描显示,去卵巢组小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度及数量均低于假手术组(P <0.05),骨小梁分离度高于假手术组(P <0.05);经过不同质量浓度绿原酸干预后,去卵巢小鼠的上述指标均有所改善,其中高剂量绿原酸组改善效果有显著性意义(P <0.05)。苏木精-伊红染色显示,去卵巢组小鼠骨量少于假手术组,经过绿原酸干预后骨量增加。(3)绿原酸可能通过BMP-2/RUNX2/SMAD4信号通路促进成骨分化,预防去卵巢小鼠的骨丢失。

关键词：绿原酸成骨基因成骨分化细胞增殖成骨诱导成骨矿化信号通路骨丢失

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负载鸢尾素微溶胶静电纺丝促进神经干细胞分化

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中华手外科杂志 2022年第1期38卷 61-65页

作者：薛源胡思涵陈迟迟刘长鹏施勤芮永军苏州大学附属第一医院苏州大学骨科研究所苏州215006 苏州大学附属无锡九院手外科无锡214026

目的探究负载鸢尾素微溶胶的静电纺丝支架对神经干细胞分化的影响。方法用微溶胶静电纺丝技术制备负载鸢尾素的静电纺丝支架(PLLA),使用透射电镜(TEM)检测纤维支架的内部结构,使用扫描电镜(SEM)检测纤维支架的形貌特征。通过等离子技术... 详细信息

目的探究负载鸢尾素微溶胶的静电纺丝支架对神经干细胞分化的影响。方法用微溶胶静电纺丝技术制备负载鸢尾素的静电纺丝支架(PLLA),使用透射电镜(TEM)检测纤维支架的内部结构,使用扫描电镜(SEM)检测纤维支架的形貌特征。通过等离子技术将鸢尾素枝接于静电纺丝支架,并测定其释放曲线。提取SD大鼠胎鼠海马区神经干细胞,通过免疫荧光染色进行细胞标志物巢蛋白(Nestin)的鉴定。观察PLLA-鸢尾素浸出液对神经干细胞分化的影响。结果TEM显示静电纺丝支架有管状结构,SEM显示其有一致的方向特征;鸢尾素可持续释放48h;提取的细胞聚团呈现出明显的球形,免疫荧光染色表明其表达NeStin;PLLA-鸢尾素浸出液可以促进神经干细胞分化。结论负载鸢尾素微溶胶静电纺丝支架可以促进神经干细胞的分化。

关键词：神经干细胞细胞分化微溶胶静电纺丝鸢尾素

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鸡HNF4α蛋白的原核表达、纯化及特异性抗体制备

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农业生物技术学报 2019年第5期27卷 927-935页

作者：王中亮胡悦郁建锋陈珏马丽晨陈迟迟姚文顾志良南京农业大学动物科技学院常熟理工学院生物与食品工程学院

肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)是核受体超家族成员之一,广泛地调控葡萄糖、胆固醇及脂肪酸代谢途径中多种基因的表达。为了获得鸡(Gallus gallus) HNF4α特异性抗体,本研究首先根据大肠杆菌(Escherichia coli... 详细信息

肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)是核受体超家族成员之一,广泛地调控葡萄糖、胆固醇及脂肪酸代谢途径中多种基因的表达。为了获得鸡(Gallus gallus) HNF4α特异性抗体,本研究首先根据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性,优化并合成鸡HNF4α基因,构建原核重组表达载体pET-30a(+)-HNF4α。其次,将该重组表达载体转化至E. coli BL21 (DE3)进行诱导表达,并对诱导温度和异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)浓度进行优化,表达产物利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)进行鉴定。最后,将HNF4α重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备抗鸡HNF4α的特异性抗体。利用间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测抗体效价,并用所得抗体进一步分析HNF4α在鸡各组织的表达情况。结果表明,经密码子优化后构建的原核重组表达载体pET-30a(+)-HNF4α可在E. coli BL21 (DE3)中高效表达,在37℃、0.5 mmol/L IPTG、诱导4 h的条件下,在上清液中有较多可溶性蛋白表达。利用SDS-PAGE检测发现,通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化获得了大小约为51.6 k D的融合蛋白且纯度达90%以上;ELISA检测抗体效价可达1∶512 000。利用该抗体分析鸡各组织蛋白表达谱发现,HNF4α在肝脏和肾脏中高表达,在小肠、睾丸中少量表达,而在其他组织几乎不表达。综上所述,本研究成功制备了效价高、特异性强的鸡HNF4α抗体,为进一步研究鸡HNF4α基因功能提供了基础资料。

关键词： HNF4α基因原核表达纯化抗体制备

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