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南极中山站伯氏肩孔南极鱼体液和肠道微生物的分离鉴定及功能分析

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大连海洋大学学报 2024年第3期 429-436页

作者：邵琪翟万营蔡爽孙凤宇陈良标上海海洋大学科技部海洋生物科学国际联合研究中心上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海海洋大学水产生物育种研究中心上海海洋大学大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室

为研究南极鱼体微生物的功能，对采自南极中山站附近海域的伯氏肩孔南极鱼(Trematomus bernacchii)体液和肠道内容物中的微生物进行筛选培养，挑选代表性菌株进行生理生化特性测定和次级代谢产物功能验证，并在活体上进行功能初探，观... 详细信息

为研究南极鱼体微生物的功能，对采自南极中山站附近海域的伯氏肩孔南极鱼(Trematomus bernacchii)体液和肠道内容物中的微生物进行筛选培养，挑选代表性菌株进行生理生化特性测定和次级代谢产物功能验证，并在活体上进行功能初探，观察在低温环境下其对宿主的影响。结果表明：分离获得的菌株主要分布在变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),通过16S rDNA基因序列比对发现，菌株Ignatzschineria sp. LJ11可能是一株潜在新种；伊格纳茨氏菌属(Ignatzschineria)和芽孢杆菌属(Bacillus)菌的菌液粗提物对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila ATCC 35654)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有明显的抑制作用；用菌株Ignatzschineria sp.LJ11和Bacillus sp.hb117饲喂的斑马鱼在低温下存活的时间较对照组更长；肠道微生物多样性分析显示，投喂Bacillus sp.hb117的斑马鱼肠道微生物中气单胞菌属(Aeromonas)细菌占比最高(超过60%),而投喂Ignatzschineria sp.LJ11的斑马鱼肠道微生物中弧菌属(Vibrio)为优势属。研究表明，在低温(18℃)条件下使用不同类型培养基从伯氏肩孔南极鱼体液和肠道内容物中分离出的多为变形菌门和厚壁菌门，这些菌株具有新型抗生素潜力，同时还有增强宿主耐寒的潜质，该发现为进一步探究极地细菌功能提供了新的思路。

关键词：南极伯氏肩孔南极鱼细菌分离抑菌作用低温

Asb14a 基因在斑马鱼肌间骨发育中的作用

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大连海洋大学学报 2024年第2期39卷 259-265页

作者：牛明慧王化敏胡瑞芹胡鹏吴智超陈良标上海海洋大学水产与生命学院上海201306 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306

为进一步研究肌间骨(intermuscular bone)发育的分子机制,利用CRISPR/Cas9打靶技术、茜素红染色及实时荧光定量PCR方法,研究了斑马鱼(Danio rerio)Asb14a基因敲除后肌间骨的发育情况。结果表明:本研究中成功构建了插入2 bp和缺失50 bp的... 详细信息

为进一步研究肌间骨(intermuscular bone)发育的分子机制,利用CRISPR/Cas9打靶技术、茜素红染色及实时荧光定量PCR方法,研究了斑马鱼(Danio rerio)Asb14a基因敲除后肌间骨的发育情况。结果表明:本研究中成功构建了插入2 bp和缺失50 bp的Asb14a基因敲除纯合斑马鱼品系;茜素红染色显示,成年Asb14a^(-/-)突变体与野生斑马鱼相比,肌间骨数量显著减少了35%(P<0.0001),说明敲除Asb14a基因会减少斑马鱼肌间骨的数量;实时荧光定量PCR结果显示,骨骼发育相关基因(bmp6、sp7、sox6、alpl、collala、sox6和smad1)在Asb14a^(-/-)突变体中的表达水平发生了显著性变化,从分子角度验证了Asb14a基因与肌间骨发育间的关联性。研究表明,Asb14a基因参与了斑马鱼肌间骨发育,敲除该基因会影响斑马鱼肌间骨的生成,这一发现为进一步研究肌间骨发育的分子机制提供了重要线索。

关键词：斑马鱼肌间骨 CRISPR/Cas9 Asb14a基因纯合突变体

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鳞头犬牙南极鱼LeptinB基因在抵御低温应激中的作用

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渔业科学进展 2023年第6期44卷 97-106页

作者：万金铭王映陈良标上海海洋大学国家海洋生物科学国际联合研究中心水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

为了探究瘦素基因(LeptinB,LepB)在斑马鱼肝脏细胞系(ZFL)低温应激中的作用,本研究根据鳞头犬牙南极鱼(Dissostichusmawsoni)LepB基因(DM-LepB)编码的氨基酸序列,克隆到构建的pTOL2-actin-EGFP质粒中(启动子为斑马鱼的β-actin)。选取Ec... 详细信息

为了探究瘦素基因(LeptinB,LepB)在斑马鱼肝脏细胞系(ZFL)低温应激中的作用,本研究根据鳞头犬牙南极鱼(Dissostichusmawsoni)LepB基因(DM-LepB)编码的氨基酸序列,克隆到构建的pTOL2-actin-EGFP质粒中(启动子为斑马鱼的β-actin)。选取Eco RⅠ和Bam HⅠ为限制酶,设计构建了pTOL2-LepB+HIS-EGFP表达载体,并转染至ZFL细胞中。选择致死温度10℃进行实验,采用流式细胞术检测了低温胁迫下细胞的存活率,使用增强型CCK-8试剂盒检测了低温条件下细胞的生长增殖情况,使用荧光探针DHE检测了细胞活性氧(ROS)含量。结果显示,Lep B基因的过表达能有效减少细胞ROS的产生,减轻细胞凋亡以应对低温胁迫。分析还显示,DM-LepB的过表达也有利于维持低温刺激下的胞内ATP水平与线粒体状态,有效减轻低温刺激对细胞的凋亡和坏死作用,对细胞冷应激起到保护作用。采用油红O染色和甘油三酯(TG)实验检测发现,DM-LepB基因能减缓低温刺激时细胞脂质的消耗,较多的脂质保留可减弱低温刺激对细胞的伤害,使得细胞能更好地抵抗低温损害。研究结果为揭示南极鱼类的低温适应分子机制提供了基础资料。。

关键词：鳞头犬牙南极鱼 LeptinB 低温应激细胞凋亡脂质代谢

南极中山站附近海水微生物多样性和宏基因组分析

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上海海洋大学学报 2022年第1期31卷 288-297页

作者：翟万营汪倩王佳华陈良标上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 上海海洋大学海洋生物科学国际联合研究中心上海201306 上海海洋大学深渊科学技术研究中心上海201306

以中国第34次南极科考采集的中山站附近海域5个站点海水样品为研究对象,通过Illumina高通量测序,鉴定微生物组成和微生物群落结构,发现中山站取样的海水中变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)最为丰富,其次为蓝细菌(Cyan... 详细信息

以中国第34次南极科考采集的中山站附近海域5个站点海水样品为研究对象,通过Illumina高通量测序,鉴定微生物组成和微生物群落结构,发现中山站取样的海水中变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)最为丰富,其次为蓝细菌(Cyanobacteria),属水平上黄杆菌属(Flavobacterium)和嗜冷杆菌属(Psychrobacter)含量最多,均超过20%。首次在南极海水中发现UBA1315属微生物,功能注释分析显示含有丰富的DNA修复基因,可能有助于适应南极恶劣环境。对中山站和罗斯海上层海水以及南北极不同地理位置海水微生物比较发现,变形菌门、拟杆菌门和蓝细菌在所有海水中普遍存在,变形菌门为优势菌,蓝细菌在南极海水中含量丰富,罗斯海上层海水比中山站海水微生物多样性丰富,且主要菌群丰度不同。初步揭示了中山站附近海域微生物群落组成,为后续进一步研究南极中山站海水微生物资源调查和功能开发研究提供一定的基础数据。

关键词：南极中山站微生物宏基因组适应

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铁离子对斑马鱼肝脏细胞应激低氧胁迫的影响

上海海洋大学学报 2022年第5期31卷 1048-1056页

作者：李根芳胡瑞芹宋汝浩陈良标上海海洋大学国家海洋生物科学国际联合研究中心上海201306 上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306 上海海洋大学海洋科学学院上海201306

为探究铁离子浓度对鱼类应激低氧胁迫的影响,本研究以模式生物斑马鱼的肝脏细胞(zebrafish liver cells,ZFL)为研究对象,分别利用柠檬酸铁胺(ammonium ferric citrate,FAC)和去铁胺(Defetoxamine,DFO)对ZFL细胞进行外源铁补充和内源及... 详细信息

为探究铁离子浓度对鱼类应激低氧胁迫的影响,本研究以模式生物斑马鱼的肝脏细胞(zebrafish liver cells,ZFL)为研究对象,分别利用柠檬酸铁胺(ammonium ferric citrate,FAC)和去铁胺(Defetoxamine,DFO)对ZFL细胞进行外源铁补充和内源及外源铁清除处理,比较不同铁离子浓度下ZFL细胞对低氧胁迫的应激反应。结果表明,低氧胁迫显著降低了ZFL细胞的增殖能力和存活率以及铁代谢相关基因的表达水平,而与对照组和内源及外源铁清除组相比,补充外源铁能够明显增强ZFL细胞在低氧胁迫下的增殖能力、存活率和铁蛋白的表达水平。同时,在外源铁补充组的ZFL细胞中,与铁吸收(tfa)、铁储存(fthl27、fthl28、fthl31)和铁输出(fpn)相关基因的mRNA表达水平均显著提高。进而又对低氧胁迫下ZFL细胞的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平进行检测,发现补充外源铁能够在一定程度上恢复ZFL细胞中ROS的水平,说明在一定范围内胞内ROS水平的增加有利于ZFL细胞应对低氧胁迫,有助于提高其在低氧环境中的生存率。

关键词：低氧胁迫斑马鱼肝脏细胞铁离子柠檬酸铁胺去铁胺活性氧

伯氏肩孔南极鱼dusp1基因在冷应激中的功能研究

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水生生物学报 2022年第8期46卷 1105-1112页

作者：王映胡玲红王化敏陈良标上海海洋大学国家海洋生物科学国际联合研究中心上海201306 上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

为了研究极地鱼类双特异性磷酸酶1 (dual-specificity phosphatase 1, dusp1)基因在低温胁迫下的作用,实验采用RT-PCR技术从Trematomus bernacchii中克隆获得了编码区含有1128个核苷酸的dusp1同源基因,可编码376个氨基酸残基。将其通过... 详细信息

为了研究极地鱼类双特异性磷酸酶1 (dual-specificity phosphatase 1, dusp1)基因在低温胁迫下的作用,实验采用RT-PCR技术从Trematomus bernacchii中克隆获得了编码区含有1128个核苷酸的dusp1同源基因,可编码376个氨基酸残基。将其通过同源重组的方法构建真核表达载体pcDNA3.1-dusp1并转染至人胚肾293T(HEK293T)细胞中,同时以pcDNA3.1空载质粒作为对照。使用荧光探针DCFH-DA检测了细胞活性氧(Reactive oxygen species assay, ROS)含量,采用流式细胞术检测了低温胁迫下细胞的存活率,采用Western Blot检测了P38/MAPK的磷酸化水平和RT-qPCR技术分析了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的mRNA表达水平。结果表明,伯氏肩孔南极鱼dusp1基因能在293T细胞中大量表达,并定位于细胞核;在低温胁迫下,与对照组相比,伯氏肩孔南极鱼dusp1基因的过表达能显著减少细胞ROS的含量和细胞凋亡率,并抑制促凋亡基因P38/MAPK的过度磷酸化和凋亡效应基因caspase-3的上调,减轻细胞在低温下的受损程度。研究表明伯氏肩孔南极鱼dusp1的过表达提高了293T细胞的抗寒能力,在细胞低温应激过程中具有保护功能。研究结果为探究极地鱼类低温适应性进化研究提供了新的证据,同时也为进一步探究冷胁迫下硬骨鱼类dusp1的功能奠定了基础。

关键词：冷应激双特异性磷酸酶1 P38/MAPK 伯氏肩孔南极鱼

斑马鱼3号染色体血红蛋白基因敲除对心血管发育的影响

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南京医科大学学报（自然科学版） 2023年第7期43卷 900-908页

作者：黄梓熙孟琳陈良标陈忠上海海洋大学水产与生命学院上海201306 上海交通大学医学院附属第六人民医院心内科上海201306

目的:研究斑马鱼3号染色体血红蛋白基因敲除后心血管发育的差异及可能的机制。方法:利用CRISPR/Cas9敲除斑马鱼3号染色体血红蛋白基因hbba2到hbae3片段,获得杂合突变体斑马鱼(Hb^(+/-))。检测Hb^(+/-)与野生型斑马鱼(WT)受精卵的血红蛋... 详细信息

目的:研究斑马鱼3号染色体血红蛋白基因敲除后心血管发育的差异及可能的机制。方法:利用CRISPR/Cas9敲除斑马鱼3号染色体血红蛋白基因hbba2到hbae3片段,获得杂合突变体斑马鱼(Hb^(+/-))。检测Hb^(+/-)与野生型斑马鱼(WT)受精卵的血红蛋白含量及分布,观察血管的发育,统计两者5月龄红细胞数量,并采用成年斑马鱼心脏转录组测序分析,qRT⁃PCR进行验证。结果:Hb^(+/-)胚胎血红蛋白含量明显减少,且在受精后50 h的胚胎中异位分布。Hb^(+/-)腹部主血管与共同基静脉相对WT发育迟缓,肠下静脉发育更快,尾部节间血管增生;而Hb^(+/-)和WT成鱼红细胞数量的差异无统计学意义(P>0.05)。对成年斑马鱼心脏转录组分析发现,血红蛋白水平降低导致nos2b、cybb上调,hif3a下调,并激活了线粒体的代偿保护机制。结论:血红蛋白基因敲除影响了胚胎时期斑马鱼的血红蛋白水平和血管发育,通过调控基因表达和线粒体的补偿机制可维持成鱼的正常生理活动。

关键词：血红蛋白心血管发育 CRISPR/Cas9 hbba2 hif3a

鲤CISH基因克隆鉴定与组织特异性表达分析

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上海海洋大学学报 2023年第3期32卷 491-499页

作者：杨慧周杰高谦刘明丽翟万营陈良标谢海侠中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室湖北武汉430072 中国科学院大学北京100049 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

克隆得到长度为1685 bp的鲤(Cyprinus carpio)CISH基因(Cytokine inducible SH-2 containing protein,CISH)的cDNA全长序列,开放阅读框(ORF)长666 bp,编码221个氨基酸,预测蛋白质分子量为24.91 ku。鲤CISH基因具有典型的SOCS家族结构特征,含有N区、中央SH2结构域和C端SOCS box结构域。系统进化分析表明,鲤CISH与同属鲤科的草鱼(Ctenopharyngodon idella)和斑马鱼(Danio rerio)的亲缘关系最近。鲤CISH基因的mRNA表达水平在血液中最高,肝脏中最低。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激后,鲤CISH基因在血液中表达量在12~24 h出现显著上升,在第48小时恢复正常水平,暗示鲤CISH基因在抵抗细菌感染过程中起作用。

关键词：鲤细胞因子信号转导抑制因子 CISH cDNA全长组织表达

南极独角雪冰鱼与尼罗罗非鱼Grik1基因的克隆及其在低温胁迫下的作用比较

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大连海洋大学学报 2023年第1期38卷 68-75页

作者：张晓雯张艳杰李玮钟文倩陈良标上海海洋大学国家海洋生物科学国际联合研究中心上海201306 上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

为了探究南极独角雪冰鱼(Chionodmco hamatus)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)离子型谷氨酸受体海人藻酸亚型1基因(glutamate ionotropic receptor kainate type subunit 1,Grik1)在低温胁迫下对细胞凋亡的影响,采用RT-PCR法克隆得到体质量约为500 g的南极独角雪冰鱼和尼罗罗非鱼Grik1基因,分别命名为ChGrik1和OnGrik1,并将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上构建pcDNA3.1-ChGrik1和pcDNA3.1-OnGrik1过表达载体,对293T细胞系进行转染,24 h后在不同温度(37、28、18、8℃)下对细胞处理48 h,然后用流式细胞仪检测不同温度下转染不同质粒的细胞凋亡情况。结果表明:低温胁迫诱导293T细胞凋亡,8℃时最显著,凋亡率达到92.43%±0.46%(P<0.05);过表达ChGrik1或OnGrik1基因相比空载组均能显著降低细胞凋亡率2%~5%(P<0.05);进一步对8℃低温胁迫48 h的细胞进行转录组测序分析显示,空载组有1346个差异表达基因,过表达ChGrik1和OnGrik1基因组均会减少受低温胁迫的差异表达基因数目,分别为722个和1053个,同时还改变了与细胞凋亡相关基因的表达趋势,如NUPR1、STC2和CHAC1等基因由下调变为上调,HSP等基因由上调变为下调。研究表明,南极独角雪冰鱼和尼罗罗非鱼的生存温度差异较大,但两者的谷氨酸受体基因Grik1功能类似,均能通过减少细胞凋亡来应对低温胁迫。

关键词：南极鱼尼罗罗非鱼低温胁迫谷氨酸受体离子型谷氨酸受体海人藻酸亚型1基因细胞凋亡