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常见酵母表达系统的菌株及其在猪用疫苗研制中的应用

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福建畜牧兽医 2024年第3期46卷 28-32页

作者：侯恩慧陈秋勇邱镜莉连春红吴学敏马玉芳周伦江王隆柏福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州350013 福建农林大学动物科学学院福州350002

近年来,猪类疫病病毒不断发生变异,给全球生猪养殖业造成了巨大的经济损失,疫苗作为最有效的防控手段,其基因工程疫苗研究工作备受关注。本文总结常见酿酒酵母、汉逊酵母和毕赤酵母表达系统菌株的优势及其在猪用疫苗研制中的应用,为今... 详细信息

近年来,猪类疫病病毒不断发生变异,给全球生猪养殖业造成了巨大的经济损失,疫苗作为最有效的防控手段,其基因工程疫苗研究工作备受关注。本文总结常见酿酒酵母、汉逊酵母和毕赤酵母表达系统菌株的优势及其在猪用疫苗研制中的应用,为今后酵母表达系统在研制猪用疫苗方面提供理论参考。

关键词：酵母菌酵母载体系统猪用疫苗

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亚抑菌浓度博落回生物碱对ExPEC主要外膜蛋白和Ⅱ型T-A系统表达的影响

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微生物学通报 2022年第6期49卷 2183-2192页

作者：侯博王晨燕栗绍文周伦江车勇良陈秋勇福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

【背景】血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱等生物碱是我国二类新兽药博落回散和博普总碱散的主要成分,具有广泛的药理作用。【目的】研究亚抑菌浓度血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱对肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escheric... 详细信息

【背景】血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱等生物碱是我国二类新兽药博落回散和博普总碱散的主要成分,具有广泛的药理作用。【目的】研究亚抑菌浓度血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱对肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)主要外膜蛋白及其调控基因和Ⅱ型毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,T-A)系统基因表达的影响,初步探讨博落回生物碱对ExPEC细菌生理活动影响的可能机制。【方法】比较不同Ⅱ型T-A系统基因yafON、hicAB、prlF-yhaV缺失的ExPEC对血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱及抗生素的最小抑菌浓度;在1/2MIC亚抑菌浓度血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱条件下,比较它们对ExPEC野生型(wild type,WT)菌株和外膜蛋白tolC缺失菌株(ΔtolC)的不同外膜蛋白基因ompC、ompX、tolC、ompF和调控基因acrR、rob、marR、rpoS、soxS表达的影响,以及对T-A系统基因yafON、hicAB、prlF-yhaV表达的影响。【结果】T-A系统hicAB和prlF-yhaV缺失菌株对氯霉素的敏感性提高2–4倍,而且hicAB缺失菌株对血根碱的敏感性也提高2倍;1/2 MIC白屈菜红碱显著促进WT和ΔtolC菌株的ompX和tolC基因表达,而血根碱抑制WT菌株tolC基因的表达;在ΔtolC菌株中1/2MIC血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱不同程度地促进ompX和ompC的基因表达,而对ompF存在着不同程度的抑制;1/2 MIC血根碱和白屈菜红碱显著促进WT和ΔtolC菌株的marR基因表达,并且血根碱还可以促进rpoS基因的表达。1/2 MIC原阿片碱显著降低WT菌株的yafN基因表达,而显著增加ΔtolC菌株的yafN基因表达水平;1/2 MIC血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱不同程度地抑制WT菌株hicA和hicB基因表达,而促进ΔtolC菌株hicA和hicB的基因表达;1/2MIC血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱不同程度地促进WT和ΔtolC菌株的prlF基因表达,而血根碱显著抑制yhaV基因表达。【结论】Ⅱ型T-A系统和外膜蛋白参与ExPEC对不同生物碱的应激反应,外膜蛋白TolC的完整性对于T-A系统参与细菌应激具有一定的影响,并且其机制可能存在不同。

关键词：肠外致病性大肠杆菌博落回生物碱亚抑菌浓度外膜蛋白毒素-抗毒素系统

猪伪狂犬病毒FJ-2012毒株的致病性与遗传特性研究

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猪伪狂犬病毒FJ-2012毒株的致病性与遗传特性研究

作者：陈秋勇福建农林大学

学位级别：硕士

猪伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病毒（PRV）引起的危害生猪养殖业的一种主要传染病,自其流行以来,已造成了巨大的经济损失。2011年以来,该病卷土重来,全国多地猪场在免疫gE基因缺失疫苗的情况下,爆发了猪伪狂犬病。为了解福建省新流行PRV... 详细信息

猪伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病毒（PRV）引起的危害生猪养殖业的一种主要传染病,自其流行以来,已造成了巨大的经济损失。2011年以来,该病卷土重来,全国多地猪场在免疫gE基因缺失疫苗的情况下,爆发了猪伪狂犬病。为了解福建省新流行PRV的致病性和遗传特性,本研究从福建省某发生疑似猪伪狂犬病的规模化猪场的病料中分离到一株野生型的伪狂犬病毒,并进行了一系列动物人工感染试验、全基因组测序及生物信息学分析。1 猪伪狂犬病毒FJ-2012毒株的分离鉴定本研究首先鉴定了收集的疑似伪狂犬病的病料,初步确认病原为PRV。随后,将病料研磨上清液接种PK-15细胞进行病毒分离,并进行一系列病毒鉴定试验。试验结果显示PK-15细胞CPE变化具有典型的伪狂犬病毒感染特征;电镜观察可见其病毒粒子具有典型的疱疹病毒形态结构;其对PRV阳性血清具有特异性荧光信号,且荧光信号高于经典毒株Min-A株;测得经纯化过的6代病毒液的TCID50为10-9.40/0.1mL。结果证实我们成功分离到一株伪狂犬病毒,并命名为PRVFJ-2012,表明该猪场存在PRV感染,是造成猪群死亡原因。2 猪伪狂犬病毒FJ-2012毒株的致病性研究为进一步探究PRV FJ-2012的致病性,本研究选用家兔、BALB/c小鼠和伪狂犬抗体阴性猪三种试验动物作为动物模型,以经典Min-A株为参考毒株,进行人工感染试验和显微病理观察。试验结果显示试验家兔FJ-2012毒株组接种后出现典型伪狂犬病临床症状,并于40h出现最高体温42.2℃;试验BALB/c小鼠FJ-2012毒株的LD50为102.69 TCID50,低于经典Min-A毒株的LD50（103.87 TCID50）;试验PRV gB抗体阴性猪接种FJ-2012毒株组与经典Min-A毒株组相比,具有高死亡率、高体温变化、明显的临床症状及剖检病变等特点;FJ-2012毒株感染发病猪具有典型的显微病理变化。以上三种动物模型的试验结果均提示猪伪狂犬病毒FJ-2012毒株的致病性高于经典PRV Min-A毒株。3 猪伪狂犬病毒FJ-2012毒株的遗传特性研究为进一步探究PRV FJ-2012基因组的分子遗传特性,本试验采SMRT测序平台进行全基因组测序,随后利用数据库资源,运用生物信息学软件对PRVFJ-2012基因组进行生物信息学分析。试验结果表明该新分离毒株与参考毒株具有广泛的分子差异性,其主要免疫基因、毒力基因和免疫逃逸相关基因存在不同程度的插入、缺失和替换;gB蛋白与经典疫苗毒株存在3处抗原差异,gE蛋白存在多处氨基酸变异,gN蛋白种群间氨基酸同源性差异大。以上结果揭示了 PRVFJ-2012毒株的分子特征,初步讨论了该病毒流行的分子基础,为伪狂犬病毒遗传演化规律提供了有力的参考依据,为下一步研制新型伪狂犬疫苗奠定了科学基础。

关键词：伪狂犬病毒分离鉴定致病性遗传特性变异

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鹤首观赏葫芦温室栽培技术

农业工程技术 2022年第28期42卷 70-74页

作者：冯海清余政强陈秋勇杨龙陈宇广西中农富玉国际农业科技有限公司广西玉林537035

鹤首葫芦作为新奇特蔬菜品种,在观光农业中成为炙手可热的品种。本文主要介绍了高架栽培鹤首葫芦育苗、移植、肥水管理等栽培技术及病虫害防治方法。

关键词：观赏葫芦鹤首葫芦玻璃温室栽培技术

新发变异伪狂犬病毒FJ2012株灭活疫苗制备和免疫效力评价

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福建农业学报 2022年第4期37卷 423-428页

作者：侯博王晨燕陈秋勇吴学敏刘玉涛王隆柏周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

【目的】比较不同种类佐剂制备的伪狂犬病毒(PRV)FJ2012株灭活疫苗的免疫效力。【方法】对PRV新发变异毒株FJ-2012的gE/gI基因采用同源重组技术缺失构建gE/gI基因缺失株(FJ-2012ΔgE/gI株),经甲醛灭活后分别与水相佐剂GEL02、两性佐剂IS... 详细信息

【目的】比较不同种类佐剂制备的伪狂犬病毒(PRV)FJ2012株灭活疫苗的免疫效力。【方法】对PRV新发变异毒株FJ-2012的gE/gI基因采用同源重组技术缺失构建gE/gI基因缺失株(FJ-2012ΔgE/gI株),经甲醛灭活后分别与水相佐剂GEL02、两性佐剂ISA 206VG和白油佐剂制成不同种类的灭活疫苗,经质量检查后免疫绵羊,免疫28 d后采用ELISA法检测各组绵羊的gB和gE抗体,并且以变异毒FJ-2012攻毒,评估不同灭活疫苗对绵羊的保护效力。【结果】成功构建了基因缺失株FJ-2012ΔgE/gI,并制备3种不同佐剂的灭活疫苗,接种绵羊后均无不良反应发生。免疫28 d后gB抗体均全部转阳,gE抗体阴性;对照组绵羊在攻毒后6 d内全部死亡(5/5),以GEL02和白油作为佐剂的灭活疫苗组绵羊全部存活(5/5),保护率达到100%,而以ISA 206VG作为佐剂的免疫组绵羊死亡2头,保护率仅为60%(3/5)。【结论】以GEL02佐剂和白油佐剂制成的FJ-2012ΔgE/gI株灭活疫苗免疫绵羊后可以抵御变异毒亲本株FJ-2012株的攻击,能够对我国目前新发变异PRV的防控提供技术保障。

关键词：伪狂犬病毒 gE/gI基因缺失免疫效力灭活疫苗

福建省猪源多黏菌素耐药基因mcr-1阳性细菌的耐药特性及分布特征

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2022年第12期50卷 1-8,17页

作者：车勇良陈秋勇陈如敬吴学敏王隆柏刘玉涛周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

【目的】了解福建省猪源mcr-1基因阳性细菌的流行性、耐药特性及分布特征。【方法】从福建省7个地市的21个猪场采集313份粪便样本,应用PCR方法筛选、分离和鉴定mcr-1基因阳性细菌;采用K-B琼脂扩散试验进行药敏检测,分析mcr-1基因阳性细... 详细信息

【目的】了解福建省猪源mcr-1基因阳性细菌的流行性、耐药特性及分布特征。【方法】从福建省7个地市的21个猪场采集313份粪便样本,应用PCR方法筛选、分离和鉴定mcr-1基因阳性细菌;采用K-B琼脂扩散试验进行药敏检测,分析mcr-1基因阳性细菌的耐药性,并使用PCR方法分析其耐药表型;进一步采用多位点序列分型(MLST)方法鉴定mcr-1基因阳性大肠杆菌的类型,使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析方法对mcr-1阳性大肠杆菌进行聚类分析,探明其分布特征和亲缘关系。【结果】从313份猪粪便中共分离获得43株mcr-1基因阳性细菌,其中大肠杆菌39株。耐药性结果显示,分离菌株对磺胺甲基异恶唑、氟苯尼考、链霉素、强力霉素、恩诺沙星、新霉素、阿莫西林、头孢噻肟、林可-壮观、亚胺培南、呋喃妥因、利奈唑胺和替加环素的耐药率分别为90.1%,83.7%,74.4%,67.4%,67.4%,58.1%,53.5%,39.5%,34.9%,11.6%,4.6%,0和0。磺胺类耐药基因中的sul1、sul2和sul3基因检出率较高,分别达到81.4%,90.7%和74.4%;喹诺酮类耐药基因中仅有qnrS和aac(6′)-Ib-cr被检出,其检出率分别为51.2%和30.2%;氯霉素类耐药基因中Cat2和cmlA基因的检出率较高,分别达到86.0%和74.4%;氟苯尼考耐药基因(floR)的检出率为83.7%;金属β-内酰胺酶耐药基因(NDM-1)的检出率为23.2%;多药耐药基因(cfr)的检出率为7.0%;而替加环素耐药基因(tet(X))未被检出。39株mcr-1基因阳性大肠杆菌除了4株不能分型外,其他35株共分为19个ST型,具有高度多样性,其中ST10为优势型,共有9株菌株。PFGE图谱显示,39株mcr-1基因阳性大肠杆菌共获得30种PFGE谱型,具有多态性特征,分为6组克隆群。【结论】福建猪源mcr-1基因阳性细菌主要为大肠杆菌,少部分为肠杆菌科其他菌株,且分离菌株具有明显的多重耐药性;mcr-1基因阳性大肠杆菌在地域分布上具有多态性和高度多样性特点。

关键词：多黏菌素耐药性耐药基因猪源mcr-1基因阳性菌福建省

基于变异PEDV的S-N融合双基因蛋白IgA-ELISA抗体检测方法的建立及应用

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中国兽医学报 2023年第2期43卷 234-239页

作者：王隆柏陈秋勇曾宪煜吴学敏车勇良陈如敬周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013 长汀县畜牧技术推广站福建长汀366300

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引发猪群腹泻的主要病原之一,给我国生猪养殖业造成了重大的经济损失。为建立IgA-ELISA抗体检测方法,本研究采用变异PEDV真核表达的S-N融合蛋白作为包被抗原,通过系列反应条件优化,建立了PEDV的IgA-ELISA抗体... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引发猪群腹泻的主要病原之一,给我国生猪养殖业造成了重大的经济损失。为建立IgA-ELISA抗体检测方法,本研究采用变异PEDV真核表达的S-N融合蛋白作为包被抗原,通过系列反应条件优化,建立了PEDV的IgA-ELISA抗体检测方法。该方法的最佳反应条件为包被抗原质量浓度2 mg/L,用5%BSA于37℃封闭2 h;将待检血清1∶50稀释于37℃作用1 h,加1∶20000稀释酶标二抗于37℃作用30 min,TMB显色10 min;以D_(450 nm)≥0.326判定为阳性,当D_(450 nm)≤0.277判定为阴性,介于两者判定为可疑。检测猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(PoRV)标准阳性血清抗体均为阴性,且重复性变异系数均低于10%。通过对我国福建地区304份样品(血清179份和乳汁125份)进行检测,并与商品试剂盒进行参照对比,总符合率达到93.2%以上,表明该试剂盒检测方法具有较高的特异性、敏感性和重复性,可用于对PEDV的IgA抗体检测。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S-N蛋白 IgA-ELISA抗体检测方法

猪圆环病毒4型Rep蛋白原核表达及多克隆抗体制备

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中国畜牧兽医 2023年第10期50卷 4188-4195页

作者：陈如敬吴学敏陈秋勇严山吴仁杰车勇良王隆柏周伦江福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程中心福州350013

【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-... 详细信息

【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-Rep;将pET-30a-Rep转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用0.5 mmol/L IPTG诱导表达重组Rep蛋白,利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白。表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA鉴定鼠源多克隆抗体的免疫原性和抗体效价。【结果】成功克隆PCV4 Re p基因,构建了可表达重组Rep蛋白的原核表达质粒;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能被PCV4阳性血清和鼠源多克隆抗体特异性识别,制备的鼠源多克隆抗体效价可达1∶16000。【结论】本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV4重组Rep蛋白,为开发PCV4血清学诊断试剂盒和开展猪场PCV4流行病学调查奠定基础。

关键词：猪圆环病毒4型(PCV4) Rep蛋白原核表达多克隆抗体

基于污染机制系统研究的废弃黄铁矿区酸性废水综合治理体系开发

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基于污染机制系统研究的废弃黄铁矿区酸性废水综合治理体系开发