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抗分选连接蛋白16纳米抗体的开发及初步应用研究

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抗分选连接蛋白16纳米抗体的开发及初步应用研究

作者：陈海伦南昌大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:纳米抗体(Nanobody,Nb)是目前已知的最小抗原结合片段,源于骆驼科或鲨鱼科的天然重链抗体,通过基因工程改造而获得,其分子量仅为传统Ig G抗体的十分之一(12～15 k Da)。Nb虽然结构简单,但仍然可以达到与传统单抗相当,甚... 详细信息

研究背景和目的:纳米抗体(Nanobody,Nb)是目前已知的最小抗原结合片段,源于骆驼科或鲨鱼科的天然重链抗体,通过基因工程改造而获得,其分子量仅为传统Ig G抗体的十分之一(12～15 k Da)。Nb虽然结构简单,但仍然可以达到与传统单抗相当,甚至更高的亲和力。此外,相比于传统单抗,Nb还具有稳定性强、易于重组表达及改造等优点。近年来在生命科学、医学诊断、食品安全检测以及环境监控等领域获得越来越多的关注。SNX16作为分选连接蛋白(Sorting Nexin,SNX)家族成员中的一种,含有保守序列PX结构域-吞噬细胞氧化酶同源性结构域(Phoxhomology,PX),参与蛋白分选及定位、信号转导等过程,与结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、动脉粥样硬化、心力衰竭、炎症、先兆子痫、肥胖等多种疾病的发生发展过程密切相关。本研究院前期开展了多项关于SNX16的研究,发现SNX16通过调控心肌细胞EGFR/ERK1/2信号通路的活性,参与心肌肥大的发生发展过程;通过IR/PI3K/AKT信号通路调节胰岛β细胞中胰岛素的合成和分泌,参与机体血糖稳态的调节;心肌细胞SNX16缺失明显缓解了ISO诱导的心脏纤维化,而髓系特异性敲除SNX16可显著增加ISO诱导的心脏纤维化。现有研究表明均SNX16是一个重要的疾病调控靶点,对其进行深入研究具有重要的意义。然而在SNX16的研究上,存在一个不佳的局面,即商业化SNX16抗体种类较少、效果不佳且价格昂贵。市面上SNX16抗体主要是多克隆抗体,容易出现批次间差异的情况,严重影响了SNX16在基础医学、疾病诊断领域的研究。本课题通过噬菌体展示等技术制备获得SNX16纳米抗体,并验证了其特异性和亲和力,期望为SNX16相关研究提供高性能的抗体试剂。实验方法与结果:1、SNX16抗原蛋白的制备:构建p ET22b-SNX16质粒并在大肠杆菌中表达,随后通过镍柱亲和层析方法纯化获得SNX16蛋白。经过SDS-PAGE和Western Blot验证,成功获得纯度较高的SNX16蛋白,其可作为靶标蛋白对天然纳米抗体噬菌体展示文库进行淘选。2、SNX16纳米抗体的淘选及鉴定:利用噬菌体展示技术进行四轮淘选,随后通过phage-ELISA及Western Blot鉴定获得阳性克隆。经过测序鉴定获得13条独特性SNX16纳米抗体序列。3、纳米抗体的验证:利用原核表达纯化的SNX16蛋白和真核表达的SNX16-EGFP融合蛋白通过Western Blot验证SNX16纳米抗体。结果筛选出两个与SNX16结合特异性高,灵敏性强的SNX16纳米抗体,分别为SNX16-4-2纳米抗体、SNX16-4-13纳米抗体。4、SNX16七价纳米抗体的开发:为了提高上述两株纳米抗体的亲和力,通过同源重组方法将其基因连接到p ET22b-C4bpα-SBP质粒上,利用自诱导方法诱导蛋白表达和镍柱纯化蛋白,并通过SDS-PAGE和Western Blot对纯化的七价纳米抗体蛋白进行验证。成功获得特异性高,灵敏性强的七价SNX16-4-2纳米抗体、SNX16-4-13纳米抗体。5、噬菌体展示纳米抗体突变文库的构建及突变子的筛选:为了进一步提高上述两株纳米抗体的亲和力,利用易错PCR等技术构建噬菌体展示纳米抗体突变文库。成功构建了库容量约为10～7pfu的SNX16-4-2、SNX16-4-13噬菌体展示纳米抗体突变文库。通过phage-ELISA及Western Blot鉴定筛选到4个结合原核表达的SNX16蛋白的突变子,分别为4-2-6、4-2-29、4-13-1、4-13-31纳米抗体。6、对纳米抗体的亲和力测定:利用非竞争性ELISA方法对七价4-2、4-13纳米抗体以及它们的突变子七价4-2-6、4-2-29、4-13-1、4-13-31纳米抗体进行了亲和力测定。七价4-2纳米抗体的亲和力达到3.15*10～7 L/mol、七价4-13纳米抗体的亲和力达到1.44*10～7 L/mol;七价4-2-6、4-2-29、4-13-1纳米抗体的亲和力有所降低,七价4-13-31纳米抗体亲和力提高了10%,为1.58*10～7 L/mol。结论:1、本课题通过大肠杆菌原核表达系统及镍柱亲和层析纯化系统,成功获得纯度较好的SNX16抗原蛋白。2、本课题从天然纳米抗体噬菌体展示文库中成功筛选获得13条独特性SNX16纳米抗体序列,为后续筛选抗SNX16的纳米抗体打下良好的基础。3、本课题通过两种策略来提高纳米抗体的亲和力。一是利用蛋白自组装技术开发七价纳米抗体;二是利用易错PCR技术构建噬菌体展示纳米抗体突变文库。经Western Blot验证七价4-2纳米抗体、七价4-13纳米抗

关键词： SNX16 噬菌体展示技术纳米抗体随机突变

佛手通癃汤治疗脾肾阳虚型脑卒中后尿潴留的临床疗效观察

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佛手通癃汤治疗脾肾阳虚型脑卒中后尿潴留的临床疗效观察

作者：陈海梅甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的:本研究通过观察佛手通癃汤治疗脾肾阳虚型脑卒中后尿潴留患者的尿潴留基线资料及临床疗效指标,初步探讨佛手通癃汤治疗脾肾阳虚型脑卒中后尿潴留的作用机制、疗效及安全性,为临床治疗该病提供相关的理论依据。方法:选取2023年01月... 详细信息

目的:本研究通过观察佛手通癃汤治疗脾肾阳虚型脑卒中后尿潴留患者的尿潴留基线资料及临床疗效指标,初步探讨佛手通癃汤治疗脾肾阳虚型脑卒中后尿潴留的作用机制、疗效及安全性,为临床治疗该病提供相关的理论依据。方法:选取2023年01月至12月期间在甘肃中医药大学第一附属医院脑病科就诊的患者70例,纳入本次研究,依照就诊的前后次序用罗马数字进行编号,采用统计学的随机数图表法将70例患者平均分为对照组和治疗组各35例,治疗组在对照组基础上选用佛手通癃汤(中药颗粒制剂)口服,温水冲服,每次200ml,每日两次,对照组予以基础治疗。每组共治疗2个疗程,每个疗程时间为2周,2个疗程后对70例患者观察指标进行积分和疗效的统计并记录,最后通过综合疗效评估佛手通癃汤治疗脾肾阳虚型脑卒中后尿潴留的临床治疗效果,并反映其临床应用的安全性。结果:在整个试验观察过程中,治疗组有1例患者脱落,对照组有2例患者脱落,总共完成试验67人,治疗组和对照组分别为34、33人。1.治疗前比较:一般资料主要有纳入患者的年龄、卒中的类型、患者性别、病程等,临床观察指标中医证候积分、尿潴留的临床程度分级、膀胱残余尿量、膀胱功能积分、患者的平均尿流率和最后的撤尿管率均显示没有统计学的意义(P>0.05),均具有可比性。2.中医的证候积分:两组通过治疗,中医的证候积分均相应的减少,存在显著的统计学差异(P<0.01)。3.临床尿潴留程度:治疗后两组潴留程度均好转,且存在统计学差异(P<0.05)。4.膀胱残余尿量:两组患者治疗后膀胱的残尿量均比治疗前减少,且存在统计学的差异(P<0.05),且治疗组的残余尿量减少更明显。5.膀胱功能的积分:两组患者治疗完成后,通过积分分析,膀胱功能比治疗开始前改善明显,且积分分析得出存在显著的统计学差异(P<0.05)。6.平均尿流率:两组治疗完成后,治疗后的平均尿流率比治疗前增加显著,且经分析存在显著的统计学差异(P<0.05),通过组间比较,尿流率增加的程度治疗组较对照组高。7.撤管率:试验结束后两组插管的人数均减少,但仍有部分未撤管,治疗完成后经分析,两组存在显著的统计学差异(P<0.05),且成功撤管的人数治疗组的较对照组的多,治疗组总体的尿管留置时间也较对照组的短,差异有统计学意义(P<0.05)。8.治疗后总的疗效比较:两组全部疗程完成后,通过评估分析,治疗组的总有效率为85.29%,对照组的为72.73%,则治疗组的总体疗效高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)。9.安全性:治疗前后的纳入患者的三大常规,肝肾功能及心电图等没有明显的异常变化,治疗过程中也未发现其他严重的不良反应,由此得出该试验的的临床安全性较好。结论:佛手通癃汤对脑卒中后尿潴留患者的临床疗效显著,能明显缩短尿潴留的病程,降低尿潴留临床程度分级、膀胱功能积分、中医证候积分、膀胱残余尿量,增大平均尿流率、提高患者的撤管率,能进一步改善排尿障碍及脾肾阳虚的临床症状,同时可以辅助卒中的恢复及减少后遗症状,且安全性良好。

关键词：佛手通癃汤脑卒中后尿潴留脾肾阳虚临床观察

空气污染短期和长期暴露与肾炎发生风险的关联研究

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空气污染短期和长期暴露与肾炎发生风险的关联研究

作者：陈海峰安徽医科大学

学位级别：硕士

柱[5]醌胺聚合物有机正极材料的合成及在锂电池中性能研究

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柱[5]醌胺聚合物有机正极材料的合成及在锂电池中性能研究

作者：陈海宝长春工业大学

学位级别：硕士

随着电动汽车等储能系统的快速发展,寻找可持续的正极材料来提高锂离子电池的能量密度已成为学术和工业研究的焦点。目前,商用锂离子电池通常以无机过渡金属氧化物作为正极材料,虽然它为人们的生活带来了极大的便利,但在使用过程中经常... 详细信息

随着电动汽车等储能系统的快速发展,寻找可持续的正极材料来提高锂离子电池的能量密度已成为学术和工业研究的焦点。目前,商用锂离子电池通常以无机过渡金属氧化物作为正极材料,虽然它为人们的生活带来了极大的便利,但在使用过程中经常存在比容量有限、生产能耗高、安全隐患和原材料成本高等缺点。因此,有必要开发比容量较高、生产能耗低、安全性能更好和原材料成本相对较低的绿色可持续正极材料。研究发现,有机正极材料具有环保、可再生、可设计、比容量大以及适合结合各种金属离子的独特结构等诸多优点,具有取代传统无机电极材料的潜力。各种有机氧化活性分子作为锂离子电池的正极材料已被广泛研究,其中醌类化合物是最具代表性的材料之一。然而醌类化合物在有机电解质中溶解严重,导致实际容量低、循环性能差等问题,这严重限制了醌类化合物的进一步发展。因此本工作以研究柱[5]醌（Pillar[5]quinone,P5Q）作为正极材料的储锂电化学行为为基础,采用简单的“醌胺聚合”,将P5Q和氨基苯聚合,制备新型的共价大环聚合物,从而提高电池的循环稳定性,改善溶解问题。具体研究内容如下:（1）合成了P5Q并进行了表征,探究了其作为正极材料在传统液体电解液中储锂性能。P5Q理论比容量446 m Ah g,实测P5Q首圈容量403 m Ah g,相当于其理论容量的90.4%。然而,循环实验表明容量衰减迅速,在100 m A g循环150圈后稳定在23 m Ah g,保持率为5.7%,这主要归因于活性物质在电解液中的大量溶解。（2）基于前一章的探究工作,从传统P5Q的结构改性入手,针对循环过程中发生溶解的问题,将三（4-氨基苯基）胺(Tris（4-aminophenyl）amine,TAPA)和P5Q通过Michael加成反应进行聚合,设计合成了几种不同比例的共价大环聚合物1-x（x=0.5、1、1.5、2）,随后探究了其在锂电池正极中的性能。在合成的所有聚合物中,聚合物1-1.5的综合电化学性能得到了显著提升,包括高可逆容量(在100 m A g时容量为251 m Ah g)和优良的循环稳定性(在100 m A g循环150圈容量降为142m Ah g)。基于循环稳定性在实际应用中所起的关键作用,故而本章选取循环稳定性最优的聚合物1-1.5进行赝电容和机理的研究。（3）与单一的正极材料P5Q相比,聚合后在提高电极循环稳定性的同时,有效降低了有机材料在液体电解液中的溶解。但由于Michael加成反应在聚合的同时会消耗部分羰基（C=O）,故而导致初始容量有所下降,所以本章将TAPA更换为4,4'-二氨基三联苯（4,4'-Diamino-p-terphenyl,DTP）进行聚合,设计合成几种不同比例的共价大环聚合物2-x（x=1/3、1/2、1、2）,在使电池的循环稳定性和倍率性能都得到明显提升的同时,大大提高了其比容量,这主要是由于减少了羰基的消耗。其中聚合物2-1表现出高可逆容量(在100 m A g时容量为247 m Ah g)和突出的循环稳定性(在100 m A g循环500圈容量降为207 m Ah g保持率为83.8%)。本章选取最优循环稳定性的聚合物2-1进行了后续赝电容和机理的研究。

关键词：有机锂离子电池有机正极材料柱醌胺聚合物储能电化学性能

我国城乡融合发展政策的历史演变及发展取向研究

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我国城乡融合发展政策的历史演变及发展取向研究

作者：陈海玲广西大学

学位级别：硕士

21世纪以来,我国城乡关系历经了城乡统筹发展、城乡一体化发展、城乡融合发展等阶段。党的十九大以来,我国的基本矛盾已经转变为人民对美好生活的向往与发展不平衡不充分之间的矛盾,而城乡发展失衡是这种不平衡不充分的生动体现。囿于... 详细信息

21世纪以来,我国城乡关系历经了城乡统筹发展、城乡一体化发展、城乡融合发展等阶段。党的十九大以来,我国的基本矛盾已经转变为人民对美好生活的向往与发展不平衡不充分之间的矛盾,而城乡发展失衡是这种不平衡不充分的生动体现。囿于城乡二元体制的存在,长期以农业积累推动工业发展,以牺牲乡村发展机会助力城市发展,致使农村发展滞后于城市,因而导致了城乡发展失衡。社会主义的本质是实现共同富裕,因此城乡融合发展是解决城乡发展不平衡不充分问题、实现城乡共同富裕的关键,是助推乡村振兴的有效举措。为解决新矛盾,党的十九大提出乡村振兴战略,明确提出要“建立健全城乡融合发展体制机制和政策体系”,并“打造共建共治共享社会治理格局”;“十四五”规划也强调要强化以工补农、以城带乡。因此,宏观上以马克思恩格斯城乡关系理论为指导方向,梳理21世纪以来我国城乡发展的政策演变,并进一步分析其演变的历史逻辑,以期对城乡融合发展的历史进程形成总体认识。在此基础上,综合运用文献研究法、历史比较研究法,探讨我国城乡融合发展的现状及困境。微观上融入共建共治共享的本土理论,以探讨城乡融合发展的政策取向。即主要从优势方补给带动弱势方发展,探讨形成以共建理念指导工业反哺农业、以共治理念指导城市反哺农村、以共享理念指导市民反哺农民、以共富理念指导东部反哺西部的城乡融合发展的政策取向,构建“城乡融合发展循环系统”,以期建立起“工农互促、城乡互补、协调发展、共同繁荣”的新型工农城乡关系,推动城乡融合发展走向深化,助推乡村振兴,最终达成城乡全体人民共同富裕的目标。

关键词：共建共治共享城乡融合发展乡村振兴共同富裕

试题创新在高中历史教学中的贯穿 ——以广东省新高考为例

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试题创新在高中历史教学中的贯穿 ——以广东省新高考为例

作者：陈海玲江西科技师范大学

学位级别：硕士

敦煌文化在国际中文教育文化教学中的应用研究

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敦煌文化在国际中文教育文化教学中的应用研究

作者：陈海婷内蒙古师范大学

学位级别：硕士

深厚多元的中国传统文化和与时俱进的当代中国文化相辅相成,奠定了国际中文教育的文化基石。同时,鉴于国际中文教育的跨文化特性,具备文化交流特点的文化点也应是文化教学内容选取的重要考量。融合多元文化且历久弥新的敦煌文化极具这... 详细信息

深厚多元的中国传统文化和与时俱进的当代中国文化相辅相成,奠定了国际中文教育的文化基石。同时,鉴于国际中文教育的跨文化特性,具备文化交流特点的文化点也应是文化教学内容选取的重要考量。融合多元文化且历久弥新的敦煌文化极具这一特点,是理想的文化教学资源,但目前其在国际中文教育中的应用研究尚缺乏整体文化视角的系统性探究。此外,在《国际中文教育用中国文化和国情教学参考框架》(下文简称《参考框架》)发布的背景下,对敦煌文化内容的选取也亟需更系统的整合与应用。因此,如何发挥敦煌文化潜能,并将其有效应用于国际中文教育文化教学中,尚需深入研究与实践探索。本文主要以国际中文教育中“文化课上的文化教学”为研究范围,以面向国际中文教育的敦煌文化为研究对象,挖掘敦煌文化在国际中文教育文化教学中的应用价值,考察敦煌文化作为文化教学内容的选用情况,及其在文化教学实践中的应用现状。在此基础上,为甄选国际中文教育中的文化教学内容提供选取例据,并结合相关问题就发挥敦煌文化在国际中文教育文化教学中的应用价值提出相关策略和建议,并在教学实践中对其进行设计和应用。具体来看,本文共分为六个部分。绪论部分通过梳理选题缘由、意义,综述研究现状与文献,阐述思路、方法及理论基础,为后续研究提供稳固基石。正文第一部分通过实地调查的方法,以《参考框架》的文化项目为参考,结合敦煌文化的特点,初步概括适用于国际中文教育文化教学的敦煌文化内容,并探索其应用价值。第二部分运用统计分析法,从内容选用维度出发,考察敦煌文化在两部文化大纲、三类文化教材中的选用概况,并以《参考框架》为指导,将提取出的敦煌文化内容进行整合,制成适用于国际中文教育的《敦煌文化教学项目表》,以资源集成,辅助资源再应用。第三部分运用问卷调查法,从实践应用维度出发,调查国际中文教师在文化教学实践中对敦煌文化的应用情况,以及汉语学习者对敦煌文化的学习现状及意愿。第四部分,基于相关研究理论与研究结果,从文化选用、教学实践及其拓展几个方面,探索敦煌文化在文化教学中的应用策略。第五部分,针对具体的教学对象,对敦煌文化在文化课堂教学、微课教学及文化体验活动中的应用进行设计,提供更丰富的应用示例。总之,本文结合敦煌文化的特点,从国际中文教育文化教学的视角出发,探索了敦煌文化在国际中文教育文化教学中的应用,以期在新时代“一带一路”建设背景下,通过国际中文教育这一途径发挥敦煌文化的教育价值与向外诠释功能。

关键词：敦煌文化国际中文教育文化教学《国际中文教育用中国文化和国情教学参考框架》