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酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化及其抗单纯疱疹病毒活性分析

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酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化及其抗单纯疱疹病毒活性分析

作者：陈志瑾第三军医大学

学位级别：硕士

肽抗生素(Peptide antibiotics)为生物体基因编码的小肽,通常由12～60个氨基酸残基构成,分子量小于5kDa。它们在动、植物中的广泛分布,提示其在生物体的生长及抗感染中发挥重要作用。虽然发现了一些阴离子型肽抗生素,但绝大多数肽抗生... 详细信息

肽抗生素(Peptide antibiotics)为生物体基因编码的小肽,通常由12～60个氨基酸残基构成,分子量小于5kDa。它们在动、植物中的广泛分布,提示其在生物体的生长及抗感染中发挥重要作用。虽然发现了一些阴离子型肽抗生素,但绝大多数肽抗生素为阳离子型。如动物的防御素(Defensins)即为一组阳离子型肽抗生素,它首先从兔的中性粒细胞中发现,而后发现在不同动物的巨噬细胞、小肠paneth细胞、上皮细胞中也有表达,具有抗细菌、抗病毒、抗真菌等多种功能。根据半胱氨酸的分布及形成二硫键的方式不同,哺乳动物的防御素分为α-,β-和θ-三个亚家族。人的防御素分子中均含有6个半胱氨酸,可形成3对二硫键。迄今已发现17种人防御素,包括6个α-防御素(HNP1-4,HD5和HD6)和11个β-防御素(HBD1-6和HBD25-29)。它们在人体遭受感染后,机体的特异性免疫建立之前发挥重要作用。在临床耐药菌问题日益严重、病毒感染又缺乏特异性治疗手段的今天,肽抗生素的发现及深入研究无疑给临床抗感染治疗点燃了新的希望。肽抗生素hPAB-β为人hBD-2的一种突变体,在我们的前期工作中通过删除hBD-2N-端三个氨基酸,在C-端添加了一个天冬酰胺获得,具有hBD-2相似的抗菌活性。在前期工作中,我们利用铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因编码的PaP3.30蛋白作为承载分子对hPAB-β进行了融合表达,融合蛋白的表达率达到细菌总蛋白的40%,但该融合蛋白的分子量(23.6 kDa)是目标肽hPAB-β(4.3 kDa)的5倍多,故实际的hPAB-β表达量不到7%,表达效率不高;后来采用串联体的方法(即将hPAB-β基因头尾相连,构建不同拷贝数的表达载体),但由于一个hPAB-β中就含有6个半胱氨酸,串联的分子越多,二硫键的形成越复杂,融合蛋白形成的包涵体溶解性越差,难以实现hPAB-β的高效制备;最后根据毕赤酵母系统表达外源蛋白产量高及可进行分泌型表达的特点,我们成功构建并实现了肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的分泌型表达,目标多肽的产量达到241.2±39mg／L,本论文报道了酵母高密度发酵肽抗生素hPAB-β的纯化,以及在获得高纯度hPAB-β后,以单纯疱疹病毒为模型,探讨了hPAB-β对疱疹病毒的杀灭作用,主要实验方法和结果如下：利用毕赤酵母易于高密度发酵的特性,在3.7L发酵罐中对重组了肽抗生素hPAB-β表达盒的pPIC9K-hPAB-β/GS 115酵母优5工程菌进行高密度发酵,在菌体达到一定生长量后,用甲醇诱导目标基因的表达,并对菌体生长曲线、目标蛋白的表达水平进行了监测。从生长曲线中可见,在种子接种后的16h内,酵母菌生长迅速,加入补料后,酵母菌继续生长,在生长32h(菌体湿重达236.7±25.3g／L)时停止补料,菌体生长速度下降,在甲醇诱导期间,菌体生长缓慢。在诱导过程中,间隔8-12h取样进行Tricine SDS-PAGE电泳分析,结果可见,在刚开始诱导时,上清中未见目标肽分泌,加入诱导剂12h后,隐约见有表达条带,尔后表达带逐渐增强,到诱导60h下罐时达到最高。用Brandford法测得3次发酵液的总蛋白浓度分别为664.0 mg／L,781.8 mg／L和721.3mg／L。用Bio-Rad公司Quantity One软件条带检测灰度分析工具对凝胶电泳后的蛋白条带进行分析,目的蛋白约占发酵上清液总蛋白的33.4%,故可知发酵上清中目的蛋白的表达量约为241.2±29.5 mg／L,实现了重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β的目标。纯化的目的不仅仅是要获得高纯度的目标产物,还要使目标产物的生物学活性在纯化过程中不丧失,这就要根据目标分子与杂质的差异设计纯化路线,经过试验摸索加以优化。考虑到hPAB-β为一阳离子小肽(pI 9.001),我们设计了10kDa膜过滤、反相层析、阳离子交换、分子筛脱盐等纯化技术对目标肽进行纯化,最终从每升发酵液中纯化得到74.9±1.5 mg目标蛋白,纯度达到98%以上,总体纯化效率为31.5%,实现了酵母表达肽抗生素hPAB-β的分离纯化。获得纯化的hPAB-β后,我们利用Western blot对目标肽进行了鉴定,目标产物能与hPAB-β的特异性抗体反应,表明纯化出的蛋白即为需要的目标物。进一步利用琼脂扩散法检测了纯化产物对革兰阴、阳细菌的杀灭活性,结果表明纯化产物具有生物学活性,为进一步开展hPAB-β的功能研究奠定了基础。病毒分离培养和分型是生殖器疱疹实验室诊断的“金标准”,通常需时2-4天,然而不同的标本类型对培养结果干扰较大。随着基因组学的进展,单纯疱疹病毒的基因组全序列均已清楚,为分子生物诊断技术(PCR、核酸探针等)在单纯疱疹病毒感染诊断中的应用奠定了良好基

关键词：肽抗生素hPAB-β 重组酵母高密度发酵表达纯化单纯疱疹病毒 PCR 病毒培养噬斑计数抗病毒活性

抗耐药性金黄色葡萄球菌嵌合药靶的设计与构建

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免疫学杂志 2011年第8期27卷 704-709,718页

作者：杨杰饶贤才侯瑞胡珍方昕陈志瑾第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室重庆400038

目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行分子建模及三维结构观察,并构建了原核表达质粒,进行嵌合基因的表达、纯化,为进一步利用其酶学活性建立抑制分子筛选系统奠定基础。方法运用Bioedit和DNAStar软件... 详细信息

目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行分子建模及三维结构观察,并构建了原核表达质粒,进行嵌合基因的表达、纯化,为进一步利用其酶学活性建立抑制分子筛选系统奠定基础。方法运用Bioedit和DNAStar软件对MRSA耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段序列和活性区结构特点及其活性发挥进行分析,设计TG-TPase嵌合药靶,并通过引物设计从MRSA菌株中克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP基因片段,进一步用引物延伸法、酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因并亚克隆至原核表达质粒pET30b中,转化Rosetta(DE3)plysS大肠埃希菌,用IPTG进行诱导表达,并小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化和Western blotting鉴定。结果设计的TG-TPase嵌合药靶包括PBP2分子的TGase活性区、绞链区的N-端,PBP2a分子绞链区C-端及完整的TPase结构域,融合基因为1 935 bp,编码645个氨基酸,等电点为7.10,相对分子质量72 000。用PCR法从MRSA菌株中成功克隆了青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达出药靶蛋白,表达结果与预期设计相符合。融合蛋白纯化分析表明,融合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上。结论成功设计、构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,并对融合蛋白进行了初步纯化,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础。

关键词： MRSA 分子设计 TG-TPase 原核表达鉴定

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柴油机油液分析状态监测系统的建立及应用

内燃机车 2005年第1期 36-39页

作者：陈志瑾吴畏张丽萍南昌铁路局机务处江西南昌330002

通过实例介绍了南昌铁路局建立并运用油液分析状态监测系统对机车柴油机工况进行监测的情况及良好的收效。实践证明,运用该系统进行综合分析,预报柴油机故障及进行油品质量监测,是一套既先进又科学的有效手段。

关键词：机车柴油机油液分析监测系统故障预报应用

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鞭毛抗原与细菌的群集运动

免疫学杂志 2006年第Z1期22卷 117-119页

作者：陈志瑾丛延广饶贤才第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆400038

群集运动是指在培养基表面某些运动细菌依赖鞭毛的群体迁移行为,涉及繁殖体细胞分化成群集细胞,发生形态、代谢以及蛋白表达等显著变化。菌细胞密度、表面接触和生理学信号均可成为群集运动的刺激因素。群集运动的关键是鞭毛的生物合成,... 详细信息

群集运动是指在培养基表面某些运动细菌依赖鞭毛的群体迁移行为,涉及繁殖体细胞分化成群集细胞,发生形态、代谢以及蛋白表达等显著变化。菌细胞密度、表面接触和生理学信号均可成为群集运动的刺激因素。群集运动的关键是鞭毛的生物合成,flhDC鞭毛操纵子是支配分化和迁移的细菌调控网络的焦点。

关键词：群集运动分子机制鞭毛抗原

重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β及其抑菌活性初步鉴定

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免疫学杂志 2010年第1期26卷 6-9,20页

作者：侯瑞饶贤才丛延广陈志瑾谭银玲杨杰胡福泉第三军医大学微生物教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038 第三军医大学微生物教研室重庆市免疫学教研室

目的探讨hPAB-β工程菌的高密度发酵方法,鉴定发酵产物中目的肽的活性。方法采用补料分批培养方法,在3.7 L发酵罐中对重组酵母菌进行高密度发酵,温度控制在30℃,pH值范围为4.95～5.05,在菌体湿重达到200～250 g/L后开始诱导,经过约50 h... 详细信息

目的探讨hPAB-β工程菌的高密度发酵方法,鉴定发酵产物中目的肽的活性。方法采用补料分批培养方法,在3.7 L发酵罐中对重组酵母菌进行高密度发酵,温度控制在30℃,pH值范围为4.95～5.05,在菌体湿重达到200～250 g/L后开始诱导,经过约50 h甲醇诱导后结束发酵。对发酵上清进行反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,通过抑菌实验对纯化产物进行活性鉴定。结果3次高密度发酵在菌体湿重分别达到235.0 g/L、210 g/L和264.8g/L时进行诱导表达,发酵上清中目标肽的表达量分别达73.7 mg/L、76.6 mg/L和74.3 mg/L。发酵上清通过反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,获得重组肽抗生素hPAB-β,该重组蛋白经抑菌实验显示了较好的抑菌活性。结论成功实现了酵母工程菌的高密度发酵,为下一步规模化制备hPAB-β奠定了基础。

关键词：肽抗生素hPAB-β 毕赤酵母高密度发酵

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先天性溶血性黄疸一例报告

中华儿科杂志 1957年第6期8卷 495-496页

作者：陈志瑾浙江舟山医院儿科

先天性溶血性黄疸是一种极罕见的疾病,在我国仅在1929年杨氏曾报告一例"似为先天性溶血性黄疸"及1954年宋、杨二氏报告一例"先天性溶血性黄疸",其他则未再发现类似报告。1956年9月28日本院发现一例,特报告于后。

关键词：

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毒K治疗60例小儿肺炎合并心力衰竭

温州医学院学报 1995年第2期25卷 122-123页

作者：陈志瑾温州市中西医结合医院儿科

毒Ｋ治疗６０例小儿肺炎合并心力衰竭温州市中西医结合医院儿科（３２５０Ｏ０）陈志瑾［关键词］小儿肺炎，心力衰竭，毒Ｋ，酚妥拉明本院自１９８４年１０月～ｌ９９２年１２月用毒Ｋ对照酚妥拉明治疗小儿肺炎合并心衰６０例，现将结... 详细信息

毒Ｋ治疗６０例小儿肺炎合并心力衰竭温州市中西医结合医院儿科（３２５０Ｏ０）陈志瑾［关键词］小儿肺炎，心力衰竭，毒Ｋ，酚妥拉明本院自１９８４年１０月～ｌ９９２年１２月用毒Ｋ对照酚妥拉明治疗小儿肺炎合并心衰６０例，现将结果分析报导如下。１、资料和方法１．...

关键词：肺炎心力衰竭毒K 酚妥拉明并发症儿童

洛阳地区男性泌尿生殖道支原体感染流行病学调查及耐药性变迁

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免疫学杂志 2010年第10期26卷 902-905页

作者：李华信陈志瑾马周建邬冬冬范俊芳解放军150中心医院检验科洛阳471031 第三军医大学微生物教研室重庆400038 洛阳市临床检验中心 471000

目的研究男性泌尿生殖系统炎症患者解脲支原体(UU)和人型支原体(MH)感染及对抗菌药物耐药情况的变迁,以了解本地区男性支原体的感染流行状况并指导临床合理选择使用抗菌药物。方法采用病原培养法和PCR方法对2009年1月～12月在我院门诊... 详细信息

目的研究男性泌尿生殖系统炎症患者解脲支原体(UU)和人型支原体(MH)感染及对抗菌药物耐药情况的变迁,以了解本地区男性支原体的感染流行状况并指导临床合理选择使用抗菌药物。方法采用病原培养法和PCR方法对2009年1月～12月在我院门诊就诊的450例泌尿生殖系统炎症患者泌尿生殖道标本进行UU和MH检测,同时进行体外药物敏感试验,并与2000年进行比较,对UU和MH的感染及体外药物敏感性的变化情况进行分析。结果 2000年131例高危人群检测结果中UU46例占35.1%,MH18例占13.7%,UU和MH混合感染24例占18.3%;2009年450例高危人群检测结果中UU151例占33.6%,MH60例占13.3%,UU和MH混合感染78例占17.3%。2009年与2000年相比,男性泌尿生殖系统UU和MH对可乐比妥和阿奇霉素的耐药率明显增高,对交沙霉素的耐药率有所改善,而强力霉素和美满霉素的耐药率相对稳定;敏感性较高的依次是强力霉素、美满霉素和交沙霉素。结论 UU和MH已成为男性泌尿生殖系统炎症的主要病原体且以UU为主。男性泌尿生殖系统感染患者的就医人数2009年比2000年显著增多,提示人们的自我保护意识明显加强。2009年与2000年相比,UU、MH的感染率以及UU和MH的混合感染率虽然变化不大,但一段时间以来都维持在较高的水平,应引起人们的高度重视。UU和MH的耐药率较高,且随着时间的变化其耐药性也随之改变。因此,临床治疗支原体感染时应尽量根据药敏结果选择敏感药物。强力霉素、美满霉素和交沙霉素可作为本地区临床经验用药的首选药物。

关键词：男性泌尿生殖道支原体感染耐药性变迁

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建立犬肺癌模型及制作方法的比较研究

中国介入影像与治疗学 2015年第9期12卷 569-572页

作者：贡桔张丽云陈志瑾夏宁王忠敏上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放射介入科上海200020

目的比较犬传染性性病肿瘤(CTVT)细胞悬液法及组织块法犬肺移植的成瘤情况。方法选取纯种比格犬20只,分为组织块组及细胞悬液组,每组各10只,于CT引导下分别行CTVT肿瘤细胞悬液及组织块肺内种植。结果细胞悬液组10只犬中7只犬最终肺内成... 详细信息

目的比较犬传染性性病肿瘤(CTVT)细胞悬液法及组织块法犬肺移植的成瘤情况。方法选取纯种比格犬20只,分为组织块组及细胞悬液组,每组各10只,于CT引导下分别行CTVT肿瘤细胞悬液及组织块肺内种植。结果细胞悬液组10只犬中7只犬最终肺内成瘤,第10周时16个接种点中最终10个成瘤,成瘤率为62.50%。组织块组10只犬13个接种点最终全部肺内成瘤,成瘤率为100%。细胞悬液组与组织块组成瘤率的差异有统计学意义(P=0.0205)。组织块组实验犬的一般情况较细胞悬液组好,未出现明显恶液质。两组均未发生致死性并发症。结论建立犬肺癌模型时,相比于细胞悬液法,组织块接种法成功率更高,且成瘤犬状态较好。

关键词：动物模型犬肺肿瘤