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七彩神仙鱼β-胸腺素基因克隆及表达分析

淡水渔业 2024年第3期54卷 78-84页

作者：彭啸温彬陈再忠高建忠上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室上海201306 上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

为了探究胸腺素基因在七彩神仙鱼(Symphysodon aquifasciatus)中的特征、进化和功能,基于转录组序列比对及生物信息学的方法对七彩神仙鱼的胸腺素进行了鉴定、基因与蛋白结构分析、系统发生分析,通过RACE技术克隆获得了七彩神仙鱼胸腺... 详细信息

为了探究胸腺素基因在七彩神仙鱼(Symphysodon aquifasciatus)中的特征、进化和功能,基于转录组序列比对及生物信息学的方法对七彩神仙鱼的胸腺素进行了鉴定、基因与蛋白结构分析、系统发生分析,通过RACE技术克隆获得了七彩神仙鱼胸腺素基因全长,利用qRT-PCR技术研究其在各组织中的表达规律,通过病原感染实验,研究了七彩神仙鱼β-胸腺素基因在病原胁迫下的表达规律。结果显示,七彩神仙鱼的胸腺素基因鉴定为胸腺素β1型,命名为dfTβ。克隆结果显示,dfTβ的全长为779 bp,ORF区序列长度为303 bp,编码100个氨基酸,其5′-UTR为43 bp,3′-UTR为433 bp,含有22个poly-A。系统发育进化分析结果显示,七彩神仙鱼β-胸腺素同尼加拉瓜湖始丽鱼β-胸腺素聚为一簇。qPCR结果显示,β-胸腺素在七彩神仙鱼各组织中均有表达,其中在肠、皮肤、鳃中表达最高,在头肾和脾中表达最低。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后,七彩神仙鱼皮肤、头肾、脾和肠中dfTβ均在短时间内显著上调,并随着时间出现先上升后下降的趋势,但各组织中上调倍数最高峰的时间不同。研究结果表明,dfTβ基因参与了七彩神仙鱼受病原刺激后的免疫应答,且表达模式不同,表明其可能在不同组织、免疫的不同阶段发挥不同的作用。

关键词：七彩神仙鱼(Symphysodon aquifasciatus) β-胸腺素基因克隆表达分析

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天子蓝盘丽鱼皮肤组织的单细胞转录组测序

南方农业学报 2024年第3期55卷 601-610,F0002页

作者：杨平刘洁陈再忠陆颖水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室(上海海洋大学) 上海201306 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室(上海海洋大学) 上海201306

【目的】通过单细胞转录组测序比较天子蓝盘丽鱼和野生阿莲卡盘丽鱼皮肤组织中与体色形成相关的基因表达模式,为深入研究鱼类体色及良种选育提供数据基础,也为盘丽鱼或其他水产鱼类进行单细胞转录组研究提供技术借鉴。【方法】利用单细... 详细信息

【目的】通过单细胞转录组测序比较天子蓝盘丽鱼和野生阿莲卡盘丽鱼皮肤组织中与体色形成相关的基因表达模式,为深入研究鱼类体色及良种选育提供数据基础,也为盘丽鱼或其他水产鱼类进行单细胞转录组研究提供技术借鉴。【方法】利用单细胞转录组测序技术对天子蓝(人工选育)和阿莲卡(野生型)2种盘丽鱼的皮肤组织进行转录组测序,经fastp质控过滤后,通过Cell Ranger比对参考基因组生成单细胞表达矩阵文件,使用Seurat进行降维聚类后构建转录组图谱,筛选出细胞类型识别与鉴定的标记基因;同时以阿莲卡盘丽鱼为对照,通过DEGseq筛选出2个样本间的差异表达基因(DEGs),并进行GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析。【结果】经单细胞转录组测序,从天子蓝、阿莲卡盘丽鱼样本中获得的原始序列(Raw reads)分别为815237286和728886552条;将2个样本整合后共捕获17035个细胞,经过滤及降维聚类后得到18个细胞簇(C0~C17),参考已知和潜在的标记基因,被注释为13种细胞类型及其亚型,基本涵盖了鱼类皮肤组织中的大部分细胞类型。基于伪批量(Pseudo-bulk)处理,从2个样本间筛选出20个DEGs(8个在天子蓝盘丽鱼皮肤组织中高表达,12个在阿莲卡盘丽鱼皮肤组织中高表达),主要注释到与气体传递、氧化代谢相关的GO功能条目。在单细胞维度,选择黑色素细胞和虹彩细胞2个细胞集群进行样本间差异分析,结果显示:在黑色素细胞中存在8个DEGs,主要富集于热应答、未折叠蛋白结合、生长因子活性、金属离子结合等信号通路。在虹彩细胞中存在25个DEGs,KEGG信号通路富集分析发现主要富集于凋亡、沙门氏菌感染和MAPK等信号通路,涉及细胞生存、应激响应和信号传导等功能。【结论】TSPAN3A、PTGES、ATF3、JUNK、GADD45GA、HSP70L、FOSAB等基因在调节天子蓝盘丽鱼皮肤体色、色素合成与沉着等方面发挥重要作用,而黑色素合成不活跃可能是导致天子蓝盘丽鱼体色较阿莲卡盘丽色更加鲜艳和绚丽的主要原因之一。

关键词：盘丽鱼单细胞转录组测序标记基因色素细胞体色

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蓝色七彩神仙鱼虹彩细胞呈色相关基因的发掘

水产学报 2024年第8期48卷 42-54页

作者：李中军温彬马腾飞刘鑫高建忠陈再忠上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心

为发掘蓝色体色中与虹彩细胞呈色相关的基因，实验选取全蓝、白化全蓝七彩神仙鱼分别与全白七彩神仙鱼的皮肤组织，进行比较转录组学分析。结果显示，全蓝与全白七彩神仙鱼皮肤组织转录组序列比对，共有2 192个差异表达基因(DEGs)，其中... 详细信息

为发掘蓝色体色中与虹彩细胞呈色相关的基因，实验选取全蓝、白化全蓝七彩神仙鱼分别与全白七彩神仙鱼的皮肤组织，进行比较转录组学分析。结果显示，全蓝与全白七彩神仙鱼皮肤组织转录组序列比对，共有2 192个差异表达基因(DEGs)，其中1 270个基因上调，922个基因下调，DEGs主要富集至嘌呤核苷酸生物合成过程、肌动蛋白结构组织、嘌呤化合物生物合成过程、氧化磷酸化和柠檬酸循环等代谢通路。白化全蓝与全白七彩神仙鱼转录组序列比对结果显示，共有3 168个DEGs，其中1 859个基因上调，1 309个基因下调，主要富集在氧化磷酸化、核糖核苷二磷酸代谢过程、ADP代谢过程、阳离子结合和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等通路。为进一步发掘与虹彩细胞呈色相关的候选基因，通过数据库比对分析，在全蓝与全白七彩神仙鱼筛选出32个DEGs，在白化全蓝与全白七彩神仙鱼筛选出38个DEGs，其中alkal2b、gpnmb、fhl2、pka与虹彩细胞发育相关，pgam、prtfdc1、pnp、slc23a1、slc2a9、rab38、rdh10、psat1、paics与虹彩细胞中鸟嘌呤合成及运输相关。本研究为深入解析鱼类蓝色结构色的形成和调控机制奠定基础。

关键词：鱼类虹彩细胞结构色蓝色

卡拉胶对七彩神仙鱼生长、酶活性和肠道微生物组成的影响

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水产科学 2024年第3期43卷 400-409页

作者：张浩然温彬潘韵超杨博添高建忠陈再忠上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室上海201306 上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心上海201306 上海海洋大学水产科学国家级试验教学示范中心上海201306

为探究黏合剂卡拉胶对七彩神仙鱼生长、消化酶活性、抗氧化酶活性和肠道微生物组成的影响,在水温(28.0±0.5)℃下,将初始体质量(10.81±2.41)g的七彩神仙鱼饲养在80 L养殖缸中,每缸15尾,投喂添加3%、6%、9%、12%和15%卡拉胶的饲料,以投... 详细信息

为探究黏合剂卡拉胶对七彩神仙鱼生长、消化酶活性、抗氧化酶活性和肠道微生物组成的影响,在水温(28.0±0.5)℃下,将初始体质量(10.81±2.41)g的七彩神仙鱼饲养在80 L养殖缸中,每缸15尾,投喂添加3%、6%、9%、12%和15%卡拉胶的饲料,以投喂不添加卡拉胶的颗粒饲料和牛心汉堡为对照,养殖56 d。结果表明:3%卡拉胶组七彩神仙鱼质量增加率和特定生长率最高,胃蛋白酶活性和前肠淀粉酶活性显著高于其他组,肝脏丙二醛含量和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著低于其他试验组;12%卡拉胶组肝脏超氧化物歧化酶活性显著高于其他试验组。在肠道微生物组成的门水平方面,3%卡拉胶组变形菌门相对丰度显著高于其他组,梭杆菌门的相对丰度减少;在属水平方面,牛心汉堡组不含有乳球菌属,3%卡拉胶组罗姆布茨菌属相对丰度显著高于其他卡拉胶组,牛心汉堡组的鲸杆菌属相对丰度显著高于其他组。添加3%的卡拉胶能够提高七彩神仙鱼的质量增加率和特定生长率,显著提高胃蛋白酶和前肠淀粉酶活性,且不会造成氧化应激,肠道变形菌、罗姆布茨菌和乳球菌的相对丰度增加。在本试验条件下,七彩神仙鱼饲料中卡拉胶的适宜添加量为3%。

关键词：七彩神仙鱼卡拉胶生长消化免疫肠道微生物组成

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七彩神仙鱼催乳素基因的克隆、定位及表达分析

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广东农业科学 2024年第4期51卷 35-44页

作者：成果温彬高建忠陈再忠上海海洋大学水产与生命学院/农业农村部淡水水产种质资源重点实验室/水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室/水产科学国家级实验教学示范中心

【目的】七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)具有特殊的亲代抚育行为，克隆并定位七彩神仙鱼催乳素基因，分析其在亲代抚育中的表达模式，为理解催乳素在七彩神仙鱼亲代抚育中的作用提供依据。【方法】通过BLASTP对七彩神仙鱼全基... 详细信息

【目的】七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)具有特殊的亲代抚育行为，克隆并定位七彩神仙鱼催乳素基因，分析其在亲代抚育中的表达模式，为理解催乳素在七彩神仙鱼亲代抚育中的作用提供依据。【方法】通过BLASTP对七彩神仙鱼全基因组进行分析，鉴定出1个催乳素基因，命名为dfprl。基于dfprl基因的CDS区，设计克隆和PCR引物，通过RACE技术克隆获得dfprl基因全长，并利用生物信息学对dfprl基因进行结构分析，对其氨基酸序列进行理化性质和进化分析。对不同抚育阶段七彩神仙鱼的脑、性腺和皮肤进行转录组分析，探究dfprl基因在亲代抚育中的表达特征，并利用原位杂交技术对dfprl基因在七彩神仙鱼皮肤中的表达进行定位。【结果】dfprl全长为1 282 bp，cDNA序列开放阅读框长度为639 bp，共编码212个氨基酸，5'-UTR为309 bp，3'-UTR为334 bp。dfprl蛋白存在PRL家族的典型结构域Hormone＿1，dfprl蛋白与慈鲷科其他鱼类PRL蛋白相似性较高，与尼加拉瓜湖始丽鱼(Archocentrus centrarchus)对应的氨基酸序列同源性最高、为96.70%。亲鱼进入抚育阶段后，dfprl在性腺和皮肤中的表达水平逐渐上升，抚育结束时表达水平下降。原位杂交结果显示，dfprl在皮肤粘液细胞中表达，且与七彩神仙鱼催乳素受体(dfprlr)表达位点重叠，在抚育早期阶段高表达。【结论】七彩神仙鱼dfprl基因高度保守，存在稳定的Hormone＿1结构域。七彩神仙鱼dfprl基因在亲代抚育阶段的皮肤中高表达，且在亲代抚育阶段的皮肤粘液细胞中与dfprlr表达位点重合，表明dfprl可能通过作用于dfprlr进而促进七彩神仙鱼独特抚育行为的发生。

关键词：七彩神仙鱼催乳素亲代抚育皮肤粘液细胞基因克隆

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七彩神仙鱼BTN1A1基因克隆及其在嗜水气单胞菌胁迫下的表达分析

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广东农业科学 2024年第4期51卷 45-53页

作者：何恺轩温彬高建忠陈再忠上海海洋大学水产与生命学院/农业农村部淡水水产种质资源重点实验室/水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室/水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

【目的】克隆七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)嗜乳脂蛋白1A1(Butyrophilin 1A1,BTN1A1)基因,分析其在病原刺激下的表达模式,为了解七彩神仙鱼BTN1A1基因功能提供依据。【方法】利用生物信息学对七彩神仙鱼2个BTN1A1基因(BTN1A1-... 详细信息

【目的】克隆七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)嗜乳脂蛋白1A1(Butyrophilin 1A1,BTN1A1)基因,分析其在病原刺激下的表达模式,为了解七彩神仙鱼BTN1A1基因功能提供依据。【方法】利用生物信息学对七彩神仙鱼2个BTN1A1基因(BTN1A1-1和BTN1A1-2)进行结构和进化分析。根据前期获得的七彩神仙鱼皮肤转录组数据,选取BTN1A1-1和BTN1A1-2基因的CDS区设计引物进行克隆。采用qRT-PCR分析BTN1A1在各组织中的表达及嗜水气单胞菌刺激下的表达模式。【结果】BTN1A1-1和BTN1A1-2的ORF序列长度为894、1275 bp,分别编码298、424个氨基酸。BTN1A1-1和BTN1A1-2蛋白均具有1个信号肽、1个Ig结构域、1个lg_like结构域和1个跨膜结构域的经典结构,BTN1A1-2还具有1个胞质结构域。七彩神仙鱼BTN1A1-1与慈鲷科其他鱼类相似性较高,与尼加拉瓜湖始丽鱼(Archocentrus centrarchus)BTNIAI对应氨基酸序列同源性最高、为94.14%。但BTN1A1-2与其他鱼类发生分离,形成独特分支。BTN1A1-1和BTN1A1-2在七彩神仙鱼各组织中均有表达,但在鳃、肠道、皮肤等与免疫相关的组织中表达量相对较高。七彩神仙鱼BTN1A1-1在嗜水气单胞菌胁迫后表达量先显著下降后上升,而BTN1A1-2表达量则先显著上升后下降。【结论】七彩神仙鱼BTN1A1-1基因相对保守,而BTN1A1-2基因在进化上较为特殊。二者在免疫刺激下的差异表达暗示其可能在七彩神仙鱼免疫防御中发生功能分化。

关键词：七彩神仙鱼嗜乳脂蛋白嗜水气单胞菌免疫调节基因表达

野生型和人工选育全蓝型七彩神仙鱼群体的遗传多样性分析

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广东农业科学 2024年第4期51卷 65-78页

作者：吉钰陈再忠温彬高建忠上海海洋大学水产与生命学院/农业农村部淡水水产种质资源重点实验室/水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室/上海水产养殖工程技术研究中心/水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

【目的】研究七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)的遗传多样性,分析野生型和两种人工选育蓝色群体的亲缘关系和遗传差异,获得与体色形成相关的候选基因组区域及位点,同时为七彩神仙鱼分类系统的制订提供参考。【方法】对9尾野生型(... 详细信息

【目的】研究七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)的遗传多样性,分析野生型和两种人工选育蓝色群体的亲缘关系和遗传差异,获得与体色形成相关的候选基因组区域及位点,同时为七彩神仙鱼分类系统的制订提供参考。【方法】对9尾野生型(WF)、8尾全蓝型(BF)和10尾白化蓝型(ABF)七彩神仙鱼个体进行全基因组重测序,获得单核苷酸多态性(SNP)位点,计算群体遗传多样性指标,分析群体遗传结构,进行群体间的选择消除分析。考虑SNP注释和突变率,结合PCR和Sanger测序,验证候选SNP。【结果】在3个七彩神仙鱼群体中共鉴定出1360293个SNP,PIC、Pi、Ho、He表明,野生型、全蓝型和白化蓝型的遗传多样性递减,选育群体的杂合度很低。系统发育进化树、群体结构分析和多态性位点主成分分析结果均显示,3个群体之间相互独立,且群体内部聚集明显。连锁不平衡衰减分析结果表明,白化蓝型群体承受着巨大的选择压力,其次是全蓝型群体。基于群体分化指数F_(ST)和Pi进行选择消除分析,结果表明,全蓝型群体的第3、12、13、18、20号染色体和白化蓝型群体的第1、16、18、19号染色体的较大区域内存在强烈的选择信号。在全蓝型群体和白化蓝型群体中分别鉴定出13个和9个候选SNP。【结论】3个七彩神仙鱼群体的遗传多样性较低,遗传关系显示出与人工选育进程的一致性。USP43、FGFR2、DENND4、MLL1基因可能与七彩神仙鱼体色形成密切相关。

关键词：七彩神仙鱼群体遗传学遗传多样性单核苷酸多态性(SNP) 选择消除分析

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神仙鱼透明鳃盖转录组解析

广东农业科学 2024年第4期51卷 54-64页

作者：张纬宇陈再忠温彬高建忠上海海洋大学水产与生命学院/农业农村部淡水水产种质资源重点实验室/水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室/上海水产养殖工程技术研究中心/水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

【目的】神仙鱼透明性状具有很高的经济价值和科研价值。探究神仙鱼透明鳃盖(Transparent gill cover,TGC)和不透明鳃盖(Opaque gill cover,OGC)之间的差异表达基因(Differential expression genes,DEG),并挖掘影响神仙鱼透明鳃盖性状... 详细信息

【目的】神仙鱼透明性状具有很高的经济价值和科研价值。探究神仙鱼透明鳃盖(Transparent gill cover,TGC)和不透明鳃盖(Opaque gill cover,OGC)之间的差异表达基因(Differential expression genes,DEG),并挖掘影响神仙鱼透明鳃盖性状的相关信号通路,可为后续筛选调控神仙鱼透明鳃盖性状的关键基因并开展相关机制研究提供理论基础。【方法】选取红顶三色品系神仙鱼的鳃盖组织为研究材料,OGC和TGC各选取6个样本。基于Illumina Novaseq 6000测序平台进行转录组学测序,利用Fastp对原始测序数据进行质控,利用Trinity软件对质控后的数据进行从头组装获得转录本(Transcript)和对应的单基因(Unigene),利用CD-HIT软件和BUSCO软件分别对初始组装序列进行去冗余分析和结果评估。去冗余后的Unigene基于序列同源性进行功能注释。利用RSEM软件计算每个样本中Unigene的表达量。使用DESeq2软件计算OGC和TGC之间的DEG。使用Goatools软件和KOBAS软件对DEG分别进行GO和KEGG通路富集分析。【结果】(1)测序数据质控后每个样本测序碱基平均错误率均低于0.1%,Q20均高于97.78%,Q30均高于93.58%,测序质量可靠。从头组装后获得200 303个Transcript,对应123 178个Unigene。组装后数据去冗余后共获得147 932个Transcript,对应108 070个Unigene,平均长度为991.85 bp,N50为2 430 bp。(2)共有40 180个Unigene在NR、KEGG、eggNOG、GO、Pfam、Swiss-Prot数据库中获得功能注释,占总体的37.98%,其中10 747个基因在6个数据库中同时被注释,占总体的26.75%。(3)TGC相对于OGC共432个DEG,其中TGC相对于OGC显著上调267个基因、下调165个基因。(4)GO富集结果显示,432个DEG主要富集在IMP生物合成过程、IMP代谢过程、“从头”IMP生物合成过程、氨基酸结合、修饰氨基酸结合等5条生物通路中。(5)KEGG富集结果显示,432个DEG主要富集在神经活性配体-受体相互作用、酪氨酸代谢、嘌呤代谢、1个叶酸碳池、苯丙氨酸代谢、核苷酸代谢、泛醌和其他萜类化合物-醌生物合成等7条生物通路中。【结论】利用转录组学测序技术获得与神仙鱼透明鳃盖性状相关的432个基因,这些基因主要参与12条信号通路。研究结果将为神仙鱼透明鳃盖性状相关基因的挖掘和功能研究提供参考。

关键词：神仙鱼转录组学透明性状差异表达基因 GO富集分析 KEGG富集分析

七彩神仙鱼C型凝集素家族成员CD302和MBL的克隆及在病原刺激下的免疫应答

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南方水产科学 2022年第6期18卷 35-43页

作者：马腾飞温彬刘鑫缪琳高建忠陈再忠上海海洋大学/水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室/农业农村部淡水水产种质资源重点实验室上海201306 上海海洋大学/水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)具独特的亲代抚育行为,前期研究发现2种C型凝集素在育幼亲本皮肤中高表达,但表达模式不同,预示着潜在的功能分化。为探究两者潜在免疫功能的差异性,克隆获得了七彩神仙鱼C型凝集素基因SaCD302和S... 详细信息

七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)具独特的亲代抚育行为,前期研究发现2种C型凝集素在育幼亲本皮肤中高表达,但表达模式不同,预示着潜在的功能分化。为探究两者潜在免疫功能的差异性,克隆获得了七彩神仙鱼C型凝集素基因SaCD302和SaMBL,并分析了病原刺激下的免疫应答模式。结果显示,SaCD302和SaMBL的开放阅读框(ORF)长度分别为741和795 bp,分别编码246和264个氨基酸。SaCD302的氨基酸序列包含一个信号肽(aa 1—29),一个CTL结构域(aa 32—169)和一个跨膜结构域(aa 184—206)。SaMBL的氨基酸序列包含两个低复杂度区域(aa 32—92和aa 104—121)和一个典型的CTL结构域(aa 137—263)。SaCD302和SaMBL的氨基酸序列与尼加拉瓜湖始丽鱼(Archocentrus centrarchus)对应氨基酸序列的同源性最高。SaCD302在各组织中均有表达,头肾中表达量最高,其次为肝脏和鳃;SaMBL在皮肤中高表达,在肠道、肝脏、脾脏和性腺中低表达。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后,SaCD302在脾脏、头肾、肠道和皮肤中的表达量均显著上调,SaMBL仅在头肾、肠道和皮肤中表达上调,且时序性不同,表明二者可能在七彩神仙鱼免疫防御中发挥不同作用。

关键词：七彩神仙鱼 C型凝集素基因 CD302 MBL qRT-PCR

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