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代谢工程改造大肠杆菌生产尸胺

生物工程学报 2024年

作者：刘存萍高聪李晓敏陈修来吴静宋伟魏婉清刘立明江南大学生物工程学院江南大学生命科学与健康工程学院

尸胺是聚酰胺生产中的关键C5单体。由于细胞内5’-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5’-phosphate， PLP)再生效率有限，导致目前发酵法生产尸胺效率较低。本研究选择一株实验室保藏的赖氨酸高产大肠杆菌LY-4为研究对象，首先通过引入尸胺合成关键... 详细信息

尸胺是聚酰胺生产中的关键C5单体。由于细胞内5’-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5’-phosphate， PLP)再生效率有限，导致目前发酵法生产尸胺效率较低。本研究选择一株实验室保藏的赖氨酸高产大肠杆菌LY-4为研究对象，首先通过引入尸胺合成关键酶-赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase， LDC)，成功构建了菌株L01，摇瓶发酵尸胺产量达1.07 g/L；随后，开发了一种双代谢通路强化策略，协同增强内源和异源PLP合成模块，从而改善胞内PLP的合成，最优菌株L11摇瓶生产尸胺产量提升至9.23 g/L；最后，在5 L发酵罐上对菌株L11生产尸胺的发酵工艺进行优化。工程菌株经48 h分批补料发酵，尸胺产量、得率、生产强度分别为54.43 g/L、0.22 g/g和1.13 g/(L·h)，具备一定的应用潜力。本研究可为构建包括尸胺在内的多种生物胺类细胞工厂提供理论依据和技术基础。

关键词：大肠杆菌代谢工程尸胺 5’-磷酸吡哆醛发酵优化

代谢工程改造微生物合成生物基单体的进展与挑战

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化工进展 2023年第8期42卷 4123-4135页

作者：高聪陈城虎陈修来刘立明江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122

单体是合成聚合物所用的小分子基础原料,目前主要来源于化石燃料。利用微生物制备生物基单体具有生产条件温和、环境友好、可持续的优势,是实现高分子材料行业绿色制造的重要途径。借助代谢工程和合成生物学元件,目前已经实现了多种单... 详细信息

单体是合成聚合物所用的小分子基础原料,目前主要来源于化石燃料。利用微生物制备生物基单体具有生产条件温和、环境友好、可持续的优势,是实现高分子材料行业绿色制造的重要途径。借助代谢工程和合成生物学元件,目前已经实现了多种单体的微生物制造,然而与石油基生产工艺相比,这些单体微生物细胞工厂的生产性能普遍较低。围绕代谢工程改造微生物合成生物基单体过程中存在的瓶颈问题,本文基于具体案例分析,从廉价底物的高效利用、提高生物基单体合成效率、强化细胞环境耐受性三个方面,总结了改造微生物合成单体的最新研究进展。同时,讨论了单体微生物细胞工厂目前存在的挑战和未来发展方向。

关键词：微生物细胞工厂塑料单体底物利用调控策略环境耐受性

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代谢工程改造微生物固定二氧化碳研究进展

化工进展 2023年第1期42卷 40-52页

作者：陶雨萱郭亮高聪宋伟陈修来江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122

微生物固定CO_(2)是实现CO_(2)资源化利用的有效策略之一,为固碳减排、节能生产与绿色合成提供了借鉴。然而,微生物在固定CO_(2)过程中存在底物利用效率低、能量需求量大、路径难优化等问题。为了解决这些问题,本文总结了6种天然CO_(2)... 详细信息

微生物固定CO_(2)是实现CO_(2)资源化利用的有效策略之一,为固碳减排、节能生产与绿色合成提供了借鉴。然而,微生物在固定CO_(2)过程中存在底物利用效率低、能量需求量大、路径难优化等问题。为了解决这些问题,本文总结了6种天然CO_(2)固定途径与5种人工CO_(2)固定途径,并从自养微生物、异养微生物和人工微生物三个方面系统分析了代谢工程改造微生物固定CO_(2)合成化学品的最新进展。在自养微生物固定CO_(2)方面,采用的策略主要包括提高CO_(2)固定途径效率、开发能量捕集系统与调节碳代谢流分布;在异养微生物固定CO_(2)方面,常用的方法主要有强化羧化途径、重构CO_(2)固定途径与优化能量供给;在人工微生物固定CO_(2)方面,主要的研究思路是设计人工CO_(2)固定途径与构建人工CO_(2)固定微生物。最后,从CO_(2)固定的关键酶、途径和微生物三方面展望了进一步提高CO_(2)固定效率的发展方向。

关键词：微生物代谢工程二氧化碳固定固碳减排

ZIF-8-戊二醛固定化细胞生产α-酮戊二酸

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化工进展 2022年第12期41卷 6522-6530页

作者：代静新宋伟陈修来刘立明吴静江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122 江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122

为了提高表达L-谷氨酸氧化酶(LGOX)重组大肠杆菌的催化稳定性,本研究采用了沸石咪唑框架(ZIF-8)涂层和戊二醛(GA)交联的组合固定技术。确定了ZIF-8和GA的工艺参数以及固定化细胞的催化性能,并对固定化重组大肠杆菌催化L-谷氨酸生产α-... 详细信息

为了提高表达L-谷氨酸氧化酶(LGOX)重组大肠杆菌的催化稳定性,本研究采用了沸石咪唑框架(ZIF-8)涂层和戊二醛(GA)交联的组合固定技术。确定了ZIF-8和GA的工艺参数以及固定化细胞的催化性能,并对固定化重组大肠杆菌催化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸(α-KG)的稳定性展开了研究。当2-甲基咪唑、醋酸锌和戊二醛的添加量分别为240mmol/L、80mmol/L和50mmol/L时,固定化细胞(E.coli@ZIF-8-GA)的比活性和活性回收率分别达到33.4U/g和95.83%。结果表明,在重复使用10个批次后,E.coli@ZIF-8-GA转化生产α-酮戊二酸的产量仍能达到70.03g/L。与游离细胞相比,固定化细胞对温度和pH的耐受性均发生显著提高。

关键词：固定化沸石咪唑框架 L-谷氨酸氧化酶 α-酮戊二酸稳定性

异养微生物固定CO_(2)的合成生物学研究进展

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生物工程学报 2022年第4期38卷 1339-1350页

作者：胡贵鹏宋伟高聪郭亮陈修来刘立明江南大学药学院江苏无锡214122 江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122

人类活动造成大气二氧化碳(CO_(2))浓度不断升高,使当今世界面临着气候变化的重大危机。微生物CO_(2)固定为实现地球“碳中和”提供了一条有前景的绿色发展路线。与自养微生物相比,异养微生物具有更快的生长速度和更先进的遗传工具,但... 详细信息

人类活动造成大气二氧化碳(CO_(2))浓度不断升高,使当今世界面临着气候变化的重大危机。微生物CO_(2)固定为实现地球“碳中和”提供了一条有前景的绿色发展路线。与自养微生物相比,异养微生物具有更快的生长速度和更先进的遗传工具,但是其固定CO_(2)的能力还很有限。近年来,基于合成生物学技术强化异养微生物CO_(2)固定受到诸多关注,主要包括优化能量供给、改造羧化途径以及基于异养微生物间接固定CO_(2)。本综述将围绕上述3个方面重点讨论异养微生物CO_(2)固定的研究进展,为将来更好地利用微生物CO_(2)固定技术实现“碳达峰、碳中和”提供参考。

关键词：二氧化碳固定合成生物学代谢工程碳达峰碳中和

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多酶级联催化合成(R)-β-酪氨酸

化工学报 2022年第1期73卷 352-361页

作者：宋伟王金辉胡贵鹏陈修来刘立明吴静江南大学药学院江苏无锡214122 江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122

目前报道的β-酪氨酸生产方法需要较为复杂的底物而且大多依赖于贵金属催化剂。为了实现生物法绿色合成β-酪氨酸,通过人工设计的级联反应,将酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸氨基变位酶进行级联,以苯酚、丙酮酸和铵盐等廉价化合物为底物合成(R)-... 详细信息

目前报道的β-酪氨酸生产方法需要较为复杂的底物而且大多依赖于贵金属催化剂。为了实现生物法绿色合成β-酪氨酸,通过人工设计的级联反应,将酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸氨基变位酶进行级联,以苯酚、丙酮酸和铵盐等廉价化合物为底物合成(R)-β-酪氨酸。通过基因挖掘筛选了所需的酶元件,并采用蛋白质工程改造,提升了限速酶的催化效率。在大肠杆菌宿主中对所筛选的酶进行共同表达,经优化获得了(R)-β-酪氨酸合成菌株E.coli S10。在1 L规模反应中,菌株E.coli S10合成(R)-β-酪氨酸的转化率达到78%,ee值>99%。利用高分辨质谱(HRMS)和核磁共振图谱(NMR)分别鉴定了纯化产物的分子量和结构,结果表明通过该级联路径可成功合成目标产物(R)-β-酪氨酸。研究工作可为(R)-β-酪氨酸的绿色酶法生产提供理论指导。

关键词：酶生物催化生物技术多酶级联催化 (R)-β-酪氨酸

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代谢工程改造大肠杆菌生产软骨素

化工学报 2023年第5期74卷 2111-2122页

作者：赵春雷郭亮高聪宋伟吴静刘佳刘立明陈修来江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品安全国际合作联合实验室江苏无锡214122 江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122

目前生物法合成软骨素的研究策略主要侧重于构建合成路径,缺乏对前体物质供应的精细化调控,从而限制了软骨素的合成效率。为了解决上述问题,本研究借助代谢工程策略,在大肠杆菌(Escherichia coli)中重构与优化了软骨素合成路径,获得了... 详细信息

目前生物法合成软骨素的研究策略主要侧重于构建合成路径,缺乏对前体物质供应的精细化调控,从而限制了软骨素的合成效率。为了解决上述问题,本研究借助代谢工程策略,在大肠杆菌(Escherichia coli)中重构与优化了软骨素合成路径,获得了合成软骨素的微生物细胞工厂,实现了发酵法生产软骨素。通过在E.coli BL21STAR(DE3)中表达UDP-葡萄糖脱氢酶(KfoF)、UDP-氨基葡萄糖异构酶(KfoA)和软骨素聚合酶(KfoC),构建了完整的软骨素合成路径。通过氨基转移酶(GlmS)和磷酸葡萄糖胺变位酶(GlmM)的基因表达水平优化,提高了软骨素合成前体UDP-GalNAc的供给量;优化KfoF的基因表达水平,改善了软骨素合成前体UDP-GlcA的供给效率。在5 L发酵罐上,最优工程菌株E.coli GZ17的软骨素产量达到了2.95 g/L。上述研究策略为硫酸软骨素菌株的构建与应用奠定了基础,也为代谢工程改造生产其他糖胺聚糖提供了借鉴。

关键词：软骨素大肠杆菌代谢工程路径优化

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光驱动二氧化碳转化系统的构建、优化与应用

生物工程学报 2023年第6期39卷 2390-2409页

作者：干雅梅郭亮高聪宋伟吴静刘立明陈修来江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品安全国际合作联合实验室江苏无锡214122 江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122

利用光能驱动二氧化碳(carbon dioxide,CO_(2))还原生产化学品对于缓解环境压力、解决能源危机具有重要意义。光捕获、光电转化和CO_(2)固定等作为影响光合作用效率的关键因素,同时也制约着CO_(2)的资源化利用效率。为了解决上述问题,... 详细信息

利用光能驱动二氧化碳(carbon dioxide,CO_(2))还原生产化学品对于缓解环境压力、解决能源危机具有重要意义。光捕获、光电转化和CO_(2)固定等作为影响光合作用效率的关键因素,同时也制约着CO_(2)的资源化利用效率。为了解决上述问题,本文从生物化学与代谢工程相结合的角度,系统总结了光驱动杂合系统的构建、优化与应用,并从酶杂合系统、生物杂合系统以及杂合系统应用3个方面分析了光驱动CO_(2)还原合成化学品的最新研究进展。在酶杂合系统方面,采用的策略主要有提升酶催化活性、增强酶稳定性等;在生物杂合系统方面,采用的方法主要包括增强生物捕光能力、优化还原力供应以及改善能量再生等;在杂合系统应用方面,主要阐述了光驱动CO_(2)还原生产一碳含能化合物、生物燃料以及生物食品等。最后,从纳米材料(包括有机材料和无机材料)和生物催化剂(包括酶和微生物)两个方面,展望了人工光合系统的进一步发展方向。

关键词：酶杂合系统生物杂合系统 CO_(2)固定能量再生还原力再生

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代谢工程改造大肠杆菌生产琥珀酸

化工进展 2022年第2期41卷 938-950页

作者：唐文秀王学明郭亮季立豪高聪陈修来刘立明江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 江南大学国际食品安全联合实验室江苏无锡214122

琥珀酸(succinic acid)是一种四碳二羧酸,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用。目前,微生物法生产琥珀酸存在得率低、生产强度低、副产物积累等问题。为此,本研究通过复合诱变(ARTP和^(60)Co-γ射线)筛选到一株耐高渗突变株FMM... 详细信息

琥珀酸(succinic acid)是一种四碳二羧酸,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用。目前,微生物法生产琥珀酸存在得率低、生产强度低、副产物积累等问题。为此,本研究通过复合诱变(ARTP和^(60)Co-γ射线)筛选到一株耐高渗突变株FMME-N-2,其琥珀酸得率为0.70g/g葡萄糖,同时积累18.8g/L乳酸、7.6g/L甲酸和17.3g/L乙酸。为了提高琥珀酸得率,通过敲除乳酸脱氢酶基因(ldhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶-甲酸转运蛋白基因(pflB-focA)、磷酸转乙酰基基因(pta)、丙酸激酶基因(tdcD)和a-酮丁酸甲酸酯裂解酶基因(tdcE),阻断冗余代谢支路减少副产物积累,获得工程菌株FMME-N-13,琥珀酸得率增加到0.92g/g葡萄糖,同时副产物大大降低,积累0.6g/L乳酸、3.6g/L甲酸和12.3g/L乙酸。同时,通过调控RBS强度组合优化来自产琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(AsPCK)和来自博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因(CbFDH)的表达水平,调控胞内ATP和NADH的浓度,最优工程菌FMME-N-26(FMME-N-13-L-AsPCK-L-CbFDH)的琥珀酸得率增加至1.04g/g葡萄糖,仅积累5.5g/L乙酸;最终,对厌氧阶段葡萄糖浓度进行优化,当葡萄糖浓度控制在0~5g/L时,菌株FMME-N-26的琥珀酸浓度增加到111.9g/L,得率为1.11g/g葡萄糖(理论产率的99%),生产强度为1.76g/L/h,为琥珀酸的工业化生产奠定了良好的基础。

关键词：琥珀酸大肠杆菌复合诱变副产物辅因子循环发酵优化