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水牛DDR1基因生物信息学及细胞学功能分析

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黑龙江畜牧兽医 2023年第9期 48-53,130,131页

作者：陆杏蓉段安琴邓廷贤马小娅杨春艳郑海英冯超黄晨茜尚江华中国农业科学院广西水牛研究所农业农村部水牛遗传繁育技术重点实验室/广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

为了了解水牛DDR1蛋白的生物信息学和细胞学功能,试验采用ProtParam、ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL、PSORTⅡPredictio、NetPhos 3.1在线软件对水牛DDR1蛋白进行生物信息学分析,采用基因干扰的方法研究水牛DDR1基因对水牛乳腺上皮细... 详细信息

为了了解水牛DDR1蛋白的生物信息学和细胞学功能,试验采用ProtParam、ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL、PSORTⅡPredictio、NetPhos 3.1在线软件对水牛DDR1蛋白进行生物信息学分析,采用基因干扰的方法研究水牛DDR1基因对水牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡、基因表达和迁移的影响。结果表明:水牛DDR1蛋白由915个氨基酸组成,分子式为C_(4538)H_(7029)N_(1261)O_(1287)S_(43),分子量为101222.99 u,半衰期为30 h,理论等电点为6.22,属于酸性、不稳定、可溶性蛋白质。DDR1蛋白的二级结构由256个α-螺旋(27.98%)、175个延伸链(19.13%)、55个β-折叠(6.01%)、429个无规则卷曲(46.89%)构成。亚细胞定位于内质网(44.4%)、高尔基体(33.3%)和质膜中(22.2%)中。DDR1蛋白共含有65个磷酸化位点,其中丝氨酸磷酸化位点35个,苏氨酸磷酸化位点18个,酪氨酸磷酸化位点12个。DDR1基因的最佳干扰片段为siDDR1-1,最佳干扰时间为48 h。DDR1基因干扰72小时时可极显著抑制水牛乳腺上皮细胞的增殖(P0.05)的表达,但对细胞凋亡率的影响不显著(P>0.05)。此外,DDR1基因干扰可极显著降低水牛乳腺上皮细胞的迁移率(P<0.01)。说明DDR1基因干扰可极显著影响水牛乳腺上皮细胞的增殖和迁移。

关键词： DDR1基因生物信息学分析乳腺上皮细胞增殖凋亡迁移

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水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

中国畜牧兽医 2022年第10期49卷 3693-3703页

作者：徐媛媛莫霞黄晨茜冯超陆杏蓉马小娅杨春艳郑海英尚江华中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001 农业农村部水牛遗传繁育技术重点实验室南宁530001

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、... 详细信息

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。

关键词：水牛 TRAIL基因克隆生物信息学分析

水牛MFSD2A基因多态性及其与产奶性状的关联分析

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中国畜牧兽医 2022年第10期49卷 3856-3865页

作者：梁莎莎庞春英邓廷贤陆杏蓉段安琴马小娅方艳艳梁贤威中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

【目的】研究水牛主要促进因子超家族成员2a(major facilitator superfamily domain containing 2a,MFSD2A)基因多态性,并筛选与水牛产奶性状相关联的SNP。【方法】采集383头健康水牛血液DNA,利用PCR扩增和Sequenom MassARRAY飞行时间... 详细信息

【目的】研究水牛主要促进因子超家族成员2a(major facilitator superfamily domain containing 2a,MFSD2A)基因多态性,并筛选与水牛产奶性状相关联的SNP。【方法】采集383头健康水牛血液DNA,利用PCR扩增和Sequenom MassARRAY飞行时间质谱技术对SNP位点进行筛选及基因型检测,并进行遗传多样性、连锁不平衡(LD)和单倍型分析,以及对不同基因型和单倍型与水牛产奶性状进行关联分析。【结果】在水牛MFSD2A基因中检出7个SNPs位点,多态信息含量(PIC)均在0.25~0.40之间,属于中度多态,除g.8290 T>C位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);关联分析结果表明,这7个SNPs位点与305 d产奶量均显著关联(PG和g.701 A>G位点与乳脂率显著关联(P野生纯合子>突变杂合子,g.568 C>G、g.3326 G>A、g.8290 T>C和g.8523 C>G位点与乳蛋白率显著关联(P0.05);连锁不平衡和单倍型分析结果明,g.568 C>G、g.701 A>G和g.3203 T>G位点可组成一个单倍型模块(Block 1),g.8523 C>G和g.9138 G>T位点可组成另一个单倍型模块(Block 2)。其中g.568 C>G和g.701 A>G、g.568 C>G和g.3326 G>A、g.8523 C>G和g.9138 G>T位点的r~2分别为0.87、0.37和0.48,处于强连锁不平衡状态。Block 1中的H1(CAG)单倍型乳蛋白率显著高于H2(CAT)和H3(GCT)(PG和g.701 A>G位点与乳脂率显著关联,g.568 C>G、g.701 A>G、g.3326 G>A、g.8290 T>C和g.8523 C>G位点与乳蛋白率显著关联,这7个SNPs位点与乳尿素氮均无显著关联。纯合子的基因型在高305 d产奶量和乳脂率的选择上更有优势,H1(CAG)和D3(GG)单倍型是提高水牛305 d产奶量和乳蛋白率的有利单倍型。

关键词：水牛 MFSD2A基因连锁不平衡产奶性状关联分析

抑制BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响

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中国畜牧兽医 2023年第6期50卷 2354-2362页

作者：徐媛媛郑海英杨春艳邓廷贤黄晨茜冯超陆杏蓉段安琴莫霞马小娅尚江华中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001 农业农村部水牛遗传繁育技术重点实验室南宁530001

【目的】探究BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响。【方法】利用脂质体转染的方法将合成的Smad 4基因的3对siRNAs(Smad4-siRNA1、Smad4-siRNA2和Smad4-siRNA3)和NC-siRNA(对照组)分别转染水牛颗粒细胞,通过... 详细信息

【目的】探究BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响。【方法】利用脂质体转染的方法将合成的Smad 4基因的3对siRNAs(Smad4-siRNA1、Smad4-siRNA2和Smad4-siRNA3)和NC-siRNA(对照组)分别转染水牛颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR检测Smad 4基因的表达水平,比较不同siRNA的干扰效率。然后利用筛选的干扰效率最高的siRNA,转染水牛卵巢颗粒细胞,通过CCK-8法检测对照组和干扰组细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR检测上述两组细胞凋亡相关基因Bax和Bcl2,细胞周期相关调控基因CyclinD2和CDK4,以及类固醇激素合成相关基因Cyp19A1和Cyp11A1的表达水平,并通过ELISA检测雌二醇(E 2)和孕酮(P 4)的含量。【结果】基因干扰试验结果表明,3对siRNAs对Smad4基因的表达均具有极显著的干扰作用(P<0.01),其中Smad4-siRNA1的干扰效率最高,达到了64%。CCK-8检测结果显示,与对照组相比,干扰组细胞的增殖效率显著降低(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,干扰组Bcl2、CyclinD2、CDK4和Cyp19A1基因的表达量均显著或极显著下调(P<0.05;P<0.01),而Cyp11A1基因的表达极显著上调(P<0.01),Bax基因的表达未受影响。ELISA检测结果表明,与对照组相比,干扰组雌二醇分泌量减少10.2%,孕酮的分泌量增加24.7%,差异均显著(P<0.05)。【结论】通过RNAi介导的Smad 4基因沉默对内源性BMP/Smad信号通路的中断不仅能够显著抑制水牛颗粒细胞的生长,而且能够诱导水牛颗粒细胞的凋亡,还会改变类固醇激素生成。BMP/Smad信号通路在调控水牛颗粒细胞生长和类固醇生成过程中具有重要的作用。

关键词：水牛 BMP/Smad信号通路 Smad 4基因颗粒细胞 RNA干扰类固醇生成

甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理对德保猪手工克隆胚胎体外发育潜能的影响

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畜牧兽医学报 2014年第8期45卷 1274-1281页

作者：陆杏蓉孙俊铭李志鹏李兰玉谢炳坤刘庆友石德顺崔奎青广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530005 广西壮族自治区畜牧研究所南宁530005

供体细胞的不完全重编程是动物克隆效率低的主要原因。本研究采用不同浓度(0.00(对照)、0.25、0.50和1.00μmol·L^(-1))的DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理德保猪耳成纤维细胞,将处理... 详细信息

供体细胞的不完全重编程是动物克隆效率低的主要原因。本研究采用不同浓度(0.00(对照)、0.25、0.50和1.00μmol·L^(-1))的DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理德保猪耳成纤维细胞,将处理后成纤维细胞作供体进行手工克隆。结果显示:各处理组细胞生长曲线均呈"S"型,其中0.25μmol·L^(-1)组细胞生长曲线与对照组最相近。随着5-Aza-CdR浓度增加,细胞均有不同程度的畸变、生长抑制甚至致死。0.00~0.50μmol·L^(-1)5-Aza-CdR处理对德保猪成纤维细胞不会显著改变其细胞染色体整倍性。5-Aza-CdR不同程度下调了德保猪耳成纤维细胞中Dnmtl、Tet1、Tet2和Tet3的相对表达,对Dnmt1、Tet1和Tet3表达量的下调呈剂量相关。以处理后成纤维细胞作供体,猪手工克隆重构胚体外发育的卵裂率(24、48 h)和桑椹胚率各组间差异不显著(P>0.05),其中0.25μmol·L^(-1)组和0.50μmol·L^(-1)组囊胚发育率显著高于1.00μmol·L^(-1)组(P0.05)。0.50μmol·L^(-1)组囊胚细胞数显著高于对照组和1.00μmol·L^(-1)组(P0.05)。综上表明:高浓度5-Aza-CdR对德保猪成纤维细胞增殖和染色体具有副作用,低浓度(≤0.25μmol·L^(-1))的5-Aza-CdR可用于供体处理以降低克隆胚胎甲基化水平及提高手工克隆猪胚胎发育潜能。

关键词：手工克隆 5-Aza-CdR 重编程

干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞乳脂和酪蛋白的影响

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中国畜牧兽医 2021年第9期48卷 3128-3137页

作者：段安琴陆杏蓉马小娅梁莎莎邓廷贤中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ(si-HSD17B4)基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 m... 详细信息

通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ(si-HSD17B4)基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 mRNA在水牛各个组织中的相对表达量。合成3条水牛HSD17B4小干扰RNA(siRNA)和1条对照si-HSD17B4-nc(si-nc),并筛选干扰效果最佳的片段和时间。si-HSD17B4转染水牛乳腺上皮细胞后,通过酪蛋白试剂盒检测酪蛋白的表达情况,通过甘油三酯测定和油红O染色检测甘油三酯含量,通过实时荧光定量PCR检测干扰HSD17B4基因对甘油三酯、脂肪酸合成以及氧化相关基因表达的影响。结果表明,HSD17B4基因在水牛心脏和卵巢中相对高表达,且显著高于其他组织(P0.05)、61.15%(P<0.01)、84.91%(P<0.01)、89.34%(P<0.01)、21.88%(P<0.01)、86.48%(P<0.01)、25.35%(P<0.01)、27.24%(P<0.01)、41.74%(P<0.01)、22.17%(P<0.01)、62.70%(P<0.01)和70.33%(P<0.01)。结果表明,HSD17B4基因在水牛组织中广泛表达;si-HSD17B4高效抑制HSD17B4基因在水牛乳腺上皮细胞中的表达,未检测到干扰HSD17B4基因对乳腺上皮细胞酪蛋白的影响,干扰HSD17B4基因上调了FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2基因的表达,从而促进甘油三酯的合成,同时降低ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因的表达,减少脂肪酸β-氧化。

关键词：水牛乳腺上皮细胞 HSD17B4 乳脂酪蛋白

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沼泽型水牛微卫星DNA的遗传多样性分析

中国畜牧兽医 2016年第11期43卷 2989-2996页

作者：邓廷贤庞春英朱鹏陆杏蓉段安琴梁贤威中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

为探究中国沼泽型水牛品种或类群的遗传多样性,本研究采用了沼泽型水牛30个微卫星标记结合LabChip芯片检测法对德昌水牛、德宏水牛、温州水牛、贵州水牛、西林水牛、富钟水牛及两个引进品种摩拉水牛、尼里-拉菲水牛等40个样本进行了检... 详细信息

为探究中国沼泽型水牛品种或类群的遗传多样性,本研究采用了沼泽型水牛30个微卫星标记结合LabChip芯片检测法对德昌水牛、德宏水牛、温州水牛、贵州水牛、西林水牛、富钟水牛及两个引进品种摩拉水牛、尼里-拉菲水牛等40个样本进行了检测和遗传多样性分析。结果表明,在30个微卫星DNA标记上共发现332个等位基因,平均基因多样性和PIC值分别为0.7808和0.7554。聚类分析结果显示,德宏水牛和德昌水牛先聚为一类,随后与富钟水牛、贵州水牛、温州水牛、西林水牛聚为一类;摩拉水牛与尼里-拉菲水牛聚为一类。本研究证实了所选的30个沼泽型水牛微卫星DNA标记可作为有效的遗传标记用于水牛品种间的遗传多样性分析,同时也丰富了当前的水牛微卫星标记资源。

关键词：水牛微卫星遗传多样性芯片检测

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LPIN1基因对水牛乳腺上皮细胞甘油三酯和脂肪酸合成的影响

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中国畜牧兽医 2020年第10期47卷 3140-3148页

作者：段安琴陆杏蓉马小娅梁莎莎邓廷贤中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

本试验旨在通过构建腺病毒pDC316-LPIN1-eGFP载体并包装出相应的脂素腺病毒颗粒(Ad-LPIN1),探索LPIN1基因对水牛乳腺上皮细胞甘油酯和脂肪酸合成的影响。将Ad-LPIN1腺病毒颗粒感染水牛乳腺上皮细胞,通过实时荧光定量PCR、免疫荧光染色(i... 详细信息

本试验旨在通过构建腺病毒pDC316-LPIN1-eGFP载体并包装出相应的脂素腺病毒颗粒(Ad-LPIN1),探索LPIN1基因对水牛乳腺上皮细胞甘油酯和脂肪酸合成的影响。将Ad-LPIN1腺病毒颗粒感染水牛乳腺上皮细胞,通过实时荧光定量PCR、免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)检测LPIN1基因和lipin1蛋白的表达情况;通过油红O染色和甘油三酯测定甘油三酯;通过实时荧光定量PCR检测LIPN1基因对甘油三酯和脂肪酸合成相关基因表达的影响。本试验成功构建pDC316-LPIN1-eGFP载体并获得高质量的Ad-LPIN1腺病毒颗粒。Ad-LPIN1腺病毒颗粒感染水牛乳腺上皮细胞(MOI=50)后LPIN1基因mRNA相对上调>5000倍,差异极显著(P<0.01),lipin1蛋白表达量增多且主要在细胞核中表达。油红O染色结果显示,过表达LPIN1基因后细胞中的脂滴明显减少。甘油三酯测定结果显示,过表达LPIN1基因后细胞中甘油三酯含量下降,差异极显著(P<0.01)。实时荧光定量PCR检测表明,LPIN1基因过表达会使过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gama,PPARγ)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor alpha,PPARα)、固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding transcription factor 1,SREBP1)基因表达量显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),同时使硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、长链脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase long chain family member 1,ACSL1)、乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-CoA carboxylase alpha,ACACA)基因表达量极显著下降,分别下调至83.17%、51.30%、44.24%和41.18%(P<0.01)。以上结果表明,腺病毒高效介导LPIN1基因在水牛乳腺上皮细胞中表达,lipin1蛋白在细胞核中的表达量增加,lipin1蛋白作为转录共同激活因子下调ACACA、FASN、ACSL1和SCD基因的表达,从而抑制甘油三酯的合成。

关键词：水牛乳腺上皮细胞 LPIN1基因甘油三酯脂肪酸

水牛HSD17B1基因启动子荧光素酶报告基因载体构建与分析

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中国畜牧兽医 2021年第10期48卷 3512-3521页

作者：陆杏蓉段安琴马小娅梁莎莎邓廷贤中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

试验旨在筛选水牛HSD17B1基因启动子活性区域及影响因素,并预测其转录结合因子,为探究该基因在水牛繁殖性能中的调控机理提供理论依据。以水牛血液基因组DNA为模板,PCR扩增得到3个HSD17B1基因启动子活性区域序列,并定向克隆至pGL3-promo... 详细信息

试验旨在筛选水牛HSD17B1基因启动子活性区域及影响因素,并预测其转录结合因子,为探究该基因在水牛繁殖性能中的调控机理提供理论依据。以水牛血液基因组DNA为模板,PCR扩增得到3个HSD17B1基因启动子活性区域序列,并定向克隆至pGL3-promoter载体;将重组质粒转染到水牛卵泡颗粒细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性,并探究其与促黄体素(luteinizing hormone,LH)和促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)的关系;利用生物信息学方法对HSD17B1基因启动子区进行转录结合因子预测。结果显示,本试验成功克隆了3个不同长度的HSD17B1基因启动子片段,并成功构建了双荧光素酶报告载体。经不同长度启动子片段的活性检测发现,pGL-pro-HSD17B1-1500活性最强,证实-866/-1500 bp为HSD17B1基因核心启动子区域,表明该区域对HSD17B1基因转录调控有重要作用。荧光素酶活性检测结果显示,添加LH可增强HSD17B1基因启动子活性。生物信息学分析发现,HSD17B1基因启动子区存在6个转录因子结合位点:Sp1(-2327/-2317 bp)、HOXA4(-2162/-2146 bp)、Sp1(-1409/-1395 bp)、Sp1(-1391/-1380 bp)、Sp1(-1345/-1319 bp)和GATA1(-812/-801 bp),但无CpG岛,有1个TATA-box和2个CAAT-box。本研究成功构建了HSD17B1基因启动子荧光素酶报告载体,确定了HSD17B1基因启动子核心区域,并证明LH可增强启动子活性。

关键词：水牛 HSD17B1基因启动子