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Gal4BD-SlugCas9/AsCas12a供体适配基因编辑系统研究

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Gal4BD-SlugCas9/AsCas12a供体适配基因编辑系统研究

作者：钱泓润西北农林科技大学

学位级别：硕士

在哺乳动物细胞中,DNA双链断裂(double strand break,DSB)主要通过同源指导修复(homology-directed repair,HDR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)两种机制进行修复。其中,HDR借助于外源供体DNA模板的重组效应能够在目标基因组位点实现精准的点编辑和基因敲入。但是,由于HDR效率远远低于NHEJ,使得HDR基因编辑策略在动物分子设计育种研究中的应用受到了极大的限制。鉴于在采用HDR策略进行基因编辑时外源供体DNA能否在DSB处有效募集是其中的一个关键问题,实验室提出了增强HDR基因编辑效果的供体适配系统(donor adapting system,DAS)的概念,并开发了CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS。该系统将酵母源的Gal4 DNA结合域(binding domain,BD)与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的Sp Cas9融合表达,将Gal4蛋白结合序列(binding sequence,BS)与双链DNA(double-stranded DNA,ds DNA)结合,籍此实现BS-ds DNA供体向DSB处募集,以提高HDR基因编辑的效率。由于Sp Cas9蛋白较大,与Gal4BD融合不利于蛋白表达、病毒包装及活体递送等过程,本研究采用了两种小型化Cas蛋白—路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的Slug Cas9变体Slug Cas9-HF与氨基酸球菌(Acidaminococcus)源的As Cas12a,进一步开发了新型的CRISPR/Gal4BD-Slug Cas9和CRISPR/Gal4BD-As Cas12a供体适配基因编辑系统。首先在报告载体水平对两套供体适配系统进行了Cas蛋白活性、系统功能验证及初步优化;进而在基因组水平进行了HDR基因编辑效率验证。主要研究内容及结果如下:1.采用重组DNA技术先后构建了p CRISPR/Gal4BD-Slug Cas9、p CRISPR/Slug Cas9-Gal4BD、p CRISPR/Gal4BD-As Cas12a和p CRISPR/As Cas12a-Gal4BD等DAS核心载体骨架4个、打靶载体6个、单链拟合(single strand annealing,SSA)活性报告载体1个、HDR效率报告载体1个、HDR-USR报告富集载体2个及ds DNA供体模版载体1个。2.通过SSA活性报告试验检测Cas蛋白活性,初步证明了Gal4BD与Slug Cas9、As Cas12a N-端融合对其活性影响较小。3.通过HDR效率报告试验验证两套供体适配系统的功能,同时优化供体设计方案,结果表明:对于CRISPR/Gal4BD-Slug Cas9 DAS,BS融合在ds DNA供体3’-端(ds DNA-BS)效果较好;对于CRISPR/Gal4BD-As Cas12a DAS,则推荐BS融合在ds DNA供体5’-端(BS-ds DNA)。4.利用CRISPR/Gal4BD-Slug Cas9 DAS对HEK293T细胞中VEGFA位点实现了高达35%的精确编辑,效率显著高于对照组。总之,本研究开发了旨在提高HDR效率的CRISPR/Gal4BD-Slug Cas9和CRISPR/Gal4BD-As Cas12a供体适配基因编辑系统并进行了初步的优化和验证,为进一步的动物基因编辑及畜禽分子设计育种研究提供了新的技术手段。

关键词：供体适配基因编辑同源指导修复 SlugCas9 AsCas12a Gal4BD

高脂日粮对小鼠不同部位脂肪沉积及血液生化指标的影响

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家畜生态学报 2019年第4期40卷 57-62页

作者：郭媛葛静楚心怡孙静宇钱泓润王世康史新娥西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室陕西杨凌712100

为了研究高脂日粮对小鼠脂肪沉积及血液生化指标的影响,选取3周龄C57BL/6J小鼠12只,随机分为高脂日粮组和低脂日粮组(对照组),每组6只。饲喂11 w后,测体重、采食量并采集血样和不同部位脂肪组织及肝脏。采用冰冻切片HE染色方法检测脂肪... 详细信息

为了研究高脂日粮对小鼠脂肪沉积及血液生化指标的影响,选取3周龄C57BL/6J小鼠12只,随机分为高脂日粮组和低脂日粮组(对照组),每组6只。饲喂11 w后,测体重、采食量并采集血样和不同部位脂肪组织及肝脏。采用冰冻切片HE染色方法检测脂肪细胞的充脂情况。结果显示,高脂日粮组与对照组相比,体重极显著增加(P<0.01),腹股沟脂肪和附睾脂肪重量显著增加(P<0.05),脂肪细胞明显增大,脂解基因和产热基因表达显著降低(P<0.05),血液中T-chol和HDL-c含量显著升高(P<0.05),ALT与AST水平显著降低(P<0.05),但AST/ALT比值偏高。以上结果表明,高脂日粮引起的肥胖是由于脂肪细胞肥大、产热基因和脂解基因表达降低以及不同部位脂肪沉积增多造成的,并且易引起肝脏炎症。

关键词：高脂日粮脂肪沉积基因表达生化指标小鼠

一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

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生物工程学报 2023年第10期39卷 4204-4218页

作者：马宝霞崔婕妤钱泓润张潇筠杨森张骐镜韩艺帆张智英王建刚徐坤西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高... 详细信息

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的SpCas9和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统(donor adapting system,DAS)。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复(homology-directed repair,HDR)效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacIDAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。

关键词：基因编辑 CRISPR/Cas9 LacI基因 LacO序列供体适配

一种新型提高HDR效率的 CRISPR/Cas9-Gal4BD 供体适配基因编辑系统

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遗传 2022年第8期44卷 708-719页

作者：张潇筠徐坤沈俊岑穆璐钱泓润崔婕妤马宝霞陈知龙张智英魏泽辉西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100

近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break,DSB)同源指导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的... 详细信息

近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break,DSB)同源指导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略,但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略,并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统(donor adapting system,DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain,Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达,将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence,Gal4BS)作为受体序列与双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体结合,以期提高HDR效率。使用***报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100~60 bp)时该系统能够提高HDR效率2~4倍。进一步的优化研究表明,融合端口和融合使用连接子(linker)的选择会影响Cas9表达效果及活性,而GGS5作为Cas9-Gal4BD融合的连接子则影响较小。同时,本研究还发现Gal4BS-dsDNA供体的差异化设计也会影响HDR效率,将Gal4BS添加到dsDNA供体5′-端的效果最佳。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS在AAVS1和EMX1位点上实现了HDR编辑效率的提高,为进一步利用该系统进行动物分子设计育种研究提供了参考和借鉴。

关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑供体DNA 供体适配同源指导修复

基于拉压杆模型的装配式混凝土挡墙结构设计方法

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东南大学学报（自然科学版） 2024年第3期54卷 639-646页

作者：蔡建国钱润民陈中向冯健东南大学混凝土及预应力混凝土结构教育部重点实验室南京211189 东南大学土木工程学院南京211189

为了研究装配式混凝土箱体挡墙结构在水压力和土压力共同作用下的受力机理,提出了一种基于拉压杆模型的装配式混凝土挡墙结构设计方法.以体积和应变能为优化目标,采用Tosca软件对数值模拟得到的主要受力骨架进行拓扑优化.构建拉压杆模型... 详细信息

为了研究装配式混凝土箱体挡墙结构在水压力和土压力共同作用下的受力机理,提出了一种基于拉压杆模型的装配式混凝土挡墙结构设计方法.以体积和应变能为优化目标,采用Tosca软件对数值模拟得到的主要受力骨架进行拓扑优化.构建拉压杆模型,结合箱体挡墙结构的破坏机理,分析并推导出侧墙受压、临水面挡墙和集束连接受拉3种主要破坏模式的承载力公式.实际工程对比分析结果表明:进行900次模型优化后,优化形态和应变能基本保持不变;基于拉压杆模型的装配式混凝土箱体挡墙结构的承载能力低于规范值和有限元模拟值,但误差均保持在16%范围内,从而验证了该方法的合理性.

关键词：装配式混凝土箱体挡墙结构受力机理数值模拟拓扑优化拉压杆模型

基于区域映射深度优化的动态多特征RGBD-SLAM算法

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中国惯性技术学报 2024年第1期32卷 42-51页

作者：陈孟元郭行荣钱润邦程浩安徽工程大学电气工程学院芜湖241000 高端装备先进感知与智能控制教育部重点实验室芜湖241000

针对RGBD-SLAM在特征提取环节,由深度相机得到的深度图易出现深度不连续以及突然出现动态物体造成轨迹误差增大的问题,提出一种基于区域映射深度优化的动态多特征RGBD-SLAM算法。利用轻量级的语义分割网络获取RGB帧中的语义信息,将得到... 详细信息

针对RGBD-SLAM在特征提取环节,由深度相机得到的深度图易出现深度不连续以及突然出现动态物体造成轨迹误差增大的问题,提出一种基于区域映射深度优化的动态多特征RGBD-SLAM算法。利用轻量级的语义分割网络获取RGB帧中的语义信息,将得到的语义掩码映射到其对应的深度图像中,并在掩码映射后的区域内进行近邻修复以完成深度图的优化。为减少动态物体对SLAM系统轨迹精度的影响,通过迭代最近点求解相机位姿,结合多视图几何得到物体位姿、运动估计矩阵以及动态视觉误差,进而估计物体运动状态并剔除动态物体。根据双向映射背景修复模型补全剔除区域的静态信息,并进行点线面特征的提取以完成定位与建图的任务。在公开数据集TUM中进行验证,实验结果表明所提算法相较于ORB-SLAM3、RGBD-SLAM、DS-SALM的平均绝对轨迹误差分别减少了78.2%、81.4%以及17.6%,表现了良好的轨迹精度与构图能力。

关键词：同时定位与地图构建深度优化剔除物体背景修复

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聚合物多孔表界面材料的构筑及给药应用

化学进展 2024年第5期36卷 679-695页

作者：陈彦臣钱泓霖郭一蓉汪璟计剑浙江大学高分子科学与工程学系教育部高分子合成与功能构造重点实验室

药械组合医用生物材料通过药物与器械的有机组合为传统医用装置的发展提供了广阔的前景。随着临床需求不断升级，开发新型表界面工程技术及药物控释机制成为研究的热点。近年来，聚合物材料多孔表界面技术通过毛细吸附作用实现功能分子... 详细信息

药械组合医用生物材料通过药物与器械的有机组合为传统医用装置的发展提供了广阔的前景。随着临床需求不断升级，开发新型表界面工程技术及药物控释机制成为研究的热点。近年来，聚合物材料多孔表界面技术通过毛细吸附作用实现功能分子与器械的快速组合，具有负载灵活、剂量可控、释放可调的特点，为推动医用生物材料药械组合的精准化、个性化提供新的潜力。本综述首先对聚合物材料多孔表界面的制备进行了总结，包括呼吸图法、模板法、表面非溶剂诱导相分离法、刺激诱导相分离法和静电纺丝法，然后阐述了基于聚合物材料多孔表界面的功能分子递送的机理和释放行为研究，接着归纳了聚合物材料多孔表界面在靶向抗癌、心血管植介入材料、骨修复材料等领域的相关研究进展，最后总结了当今聚合物多孔表界面研究面临的挑战，并对其发展方向进行了展望。

关键词：药械组合多孔材料表界面工程药物递送

共同富裕背景下宅基地市场化改革的实践研究——以浙江省义乌市为例

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中国国土资源经济 2024年

作者：钱泓澎中共义乌市委党校

市场化是共同富裕与宅基地制度改革的实践逻辑交点。文章以义乌市宅基地改革为例，将其改革举措细分为有偿使用、有偿调剂、使用权抵押、有偿退出等方面，尽管每一项改革的供需对象、交易范围有限，但所取得的经济效益显著，将宅基地使... 详细信息

市场化是共同富裕与宅基地制度改革的实践逻辑交点。文章以义乌市宅基地改革为例，将其改革举措细分为有偿使用、有偿调剂、使用权抵押、有偿退出等方面，尽管每一项改革的供需对象、交易范围有限，但所取得的经济效益显著，将宅基地使用从过去的无偿、无期限转变为分类、有期限、有偿使用，使政府、村集体、村民均有一定收益，产生了明显的共富效应。然而义乌的改革仍存在一些问题，如资格权认定困难、有偿使用标准制定困难、使用权抵押的认知片面，以及“集地券”退出宅基地模式难以复制等。建议在后续改革中，应针对问题统筹协调资格权认定，进一步细化有偿使用收费标准，完善宅基地使用权抵押及其配套制度，同时联动开展“集地券”改革。

关键词：共同富裕宅基地市场化改革义乌市

城市动物园沉浸式展区设计探索——以南京市红山森林动物园亚洲灵长区为例

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野生动物学报 2024年

作者：钱泓宇沈志军崔中雨郭苏明南京林业大学风景园林学院南京市红山森林动物园

沉浸式展区是在动物园展区设计发展过程中形成的新型动物展示模式，能够有效提升动物福利及游客观展体验。以南京市红山森林动物园亚洲灵长区为研究案例，从动物生态友好、游客观感体验和园区管理高效3方面入手，深入探讨21世纪现代动... 详细信息

沉浸式展区是在动物园展区设计发展过程中形成的新型动物展示模式，能够有效提升动物福利及游客观展体验。以南京市红山森林动物园亚洲灵长区为研究案例，从动物生态友好、游客观感体验和园区管理高效3方面入手，深入探讨21世纪现代动物园沉浸式展区设计的方法和策略，以期在有限的空间中更好地展示野生动物的自然行为，提升科普教育、自然教育效果，为动物园沉浸式展区设计提供借鉴。

关键词：城市动物园动物园设计沉浸式展区南京市红山森林动物园亚洲灵长区