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抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9单抗轻重链可变区基因克隆与序列分析

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浙江大学学报（医学版） 2007年第4期36卷 348-354页

作者：宁铂涛汤永民曹江沈红强钱柏芹浙江大学医学院附属儿童医院血液肿瘤科浙江杭州310003

目的:获取抗人CD14单克隆抗体(单抗)ZCH-7-2F9(简称2F9)轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,为2F9单链抗体(ScFv2F9)的构建奠定基础。方法:复苏2F9和NS-1细胞株,并亚克隆2F9细胞株,从其最佳克隆93A10提取总RNA,RQ1 RNase-Free DNase处... 详细信息

目的:获取抗人CD14单克隆抗体(单抗)ZCH-7-2F9(简称2F9)轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,为2F9单链抗体(ScFv2F9)的构建奠定基础。方法:复苏2F9和NS-1细胞株,并亚克隆2F9细胞株,从其最佳克隆93A10提取总RNA,RQ1 RNase-Free DNase处理污染的DNA,与NS-1细胞进行同步对照,通过RT-PCR,扩增获得2F9单抗VL基因和VH基因,分别克隆入pGEM○R-T Easy载体,然后转化DH5α细菌,酶切鉴定并纯化阳性重组子,测序后进行在线核苷酸序列分析。结果:2F9单抗VL基因全长321 bp,编码107个氨基酸,归属于小鼠Ig的Vκ基因,氨基酸序列分析结果显示,VL含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR),在第23位和第88位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸;其VH基因全长360 bp,编码120个氨基酸,归属于小鼠Ig的VH基因,氨基酸序列分析结果显示,VH含有明确的4个框架区和3个抗原决定簇互补区,在第22位和第96位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸。结论:经核苷酸序列分析证明所克隆的基因分别是2F9单抗的VL和VH基因,为2F9基因工程抗体研究奠定了坚实的基础。

关键词：抗体,单克隆抗原,CD14 序列分析免疫球蛋白可变区/遗传学基因

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流式细胞术快速确诊小儿血小板无力症

中华儿科杂志 2003年第5期41卷 375-376页

作者：傅海东沈红强钱柏芹汤永民宋华石淑文杨世隆浙江大学医学院附属儿童医院杭州310003

血小板无力症(glanzmann's thrombasthenia，CT)是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，其发病机理是由于血小板膜纤维蛋白原受体CPⅡ-b／Ⅲ-a糖蛋白缺乏，使血小板不能聚集所致。临床主要表现为反复出血。血小板糖蛋白CPⅡ-b／Ⅲ-a归属... 详细信息

血小板无力症(glanzmann's thrombasthenia，CT)是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，其发病机理是由于血小板膜纤维蛋白原受体CPⅡ-b／Ⅲ-a糖蛋白缺乏，使血小板不能聚集所致。临床主要表现为反复出血。血小板糖蛋白CPⅡ-b／Ⅲ-a归属于CD-(41a)/CD-(61)，采用抗人CD-(41a)／CD-(61)和流式细胞术(FCM)能从分子水平对CT作出明确诊断。最近本院诊断了4例，报告如下。

关键词：流式细胞术小儿血小板无力症常染色体隐性遗传性疾病血小板膜糖蛋白

小儿中性粒细胞CD_(11b)表达及其临床意义

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中华儿科杂志 2001年第9期39卷 561-562页

作者：罗社声汤永民陈莲香钱柏芹沈红强浙江大学医学院附属儿童医院内科杭州310003 浙江大学医学院附属儿童医院白血病实验室杭州310003

CD11/CD18是细胞粘附分子中整合素家族成员之一.国外有人认为中性粒细胞CD11b测定可作为新生儿感染的早期指标[1].本研究对130例不同疾病小儿中性粒细胞CD11b进行了流式细胞仪(FCM)分析,并对其中30例急性肺炎作了动态观察,以探讨中性粒... 详细信息

CD11/CD18是细胞粘附分子中整合素家族成员之一.国外有人认为中性粒细胞CD11b测定可作为新生儿感染的早期指标[1].本研究对130例不同疾病小儿中性粒细胞CD11b进行了流式细胞仪(FCM)分析,并对其中30例急性肺炎作了动态观察,以探讨中性粒细胞CD11b在儿童感染时的临床意义.

关键词：中性粒细胞CD11b 表达儿童

流式细胞术检测PP65抗原血症在诊断巨细胞病毒感染上的应用

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中华儿科杂志 2005年第1期43卷 13-17页

作者：魏健汤永民郑季彦张晨美王燕儿沈红强钱柏芹杭州浙江大学医学院附属儿童医院儿内科 310003

目的　探讨流式细胞技术检测PP6 5抗原血症对巨细胞病毒 (CMV)感染的诊断价值。方法　对 136例CMV感染患儿流式细胞技术检测血PP6 5抗原、实时荧光定量PCR(RFQ PCR)检测尿CMVDNA及血清ELISA法检测CMVIgM ,比较 3种方法的检测结果 ,并以... 详细信息

目的　探讨流式细胞技术检测PP6 5抗原血症对巨细胞病毒 (CMV)感染的诊断价值。方法　对 136例CMV感染患儿流式细胞技术检测血PP6 5抗原、实时荧光定量PCR(RFQ PCR)检测尿CMVDNA及血清ELISA法检测CMVIgM ,比较 3种方法的检测结果 ,并以 35例非CMV感染的患儿作为PP6 5检测的阴性对照。对 18例PP6 5抗原阳性患儿进行短期随访。结果　 136例CMV感染患儿从血单个核细胞 (MNC)中检出PP6 5抗原 118例 (118/ 136 ,阳性率 86 8% )。其中 5 3例患儿分别作MNC和多形核白细胞 (PMNL)检测 ,从MNC中检出PP6 5抗原 4 5例 (45 / 5 3,阳性率 84 9% ) ,PMNL中检出PP6 5抗原 4 3例 (43/ 5 3,阳性率 81 1% ) ,MNC与PMNL阳性率差异无统计学意义 (χ2 m=0 2 5 ,P >0 0 5 )。PP6 5与尿CMVDNA2种方法所检测的结果间差异无统计学意义 (χ2 m=1 78,P >0 0 5 ) ;但PP6 5与血CMVIgM检测结果间差异有统计学意义 (χ2 m=5 2 92 ,P <0 0 1)。PP6 5抗原水平与CMV感染的病情程度有明显相关性 ,全身性感染通常伴高水平抗原血症 ,单脏器感染抗原水平相对较低或阴性(χ2 =38 5 1,P <0 0 0 5 )。PP6 5在感染恢复期转为阴性或低水平 ,病情恶化时明显增高。结论　流式细胞技术检测PP6 5抗原血症是诊断活动性CMV感染的有效手段 ,量化结?

关键词： PP65 抗原 CMV感染血症诊断阳性率检出 DNA 应用检测结果

抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9单链抗体的真核表达和初步鉴定

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中华儿科杂志 2008年第8期46卷 605-609页

作者：宁铂涛汤永民曹江沈红强钱柏芹浙江大学附属儿童医院血液肿瘤科杭州310003 浙江大学附属邵逸夫医院临床实验室

目的在真核细胞中表达Zhejiang Children’s Hospital（ZCH）-7-2F9（简称2F9）单链抗体（scFv2F9）以获得高活性的目的蛋白，为2F9其他类型的基因工程抗体及其免疫毒素的研究奠定基础。方法根据pSectag2A多克隆位点、（G4S）3及scFv2F... 详细信息

目的在真核细胞中表达Zhejiang Children’s Hospital（ZCH）-7-2F9（简称2F9）单链抗体（scFv2F9）以获得高活性的目的蛋白，为2F9其他类型的基因工程抗体及其免疫毒素的研究奠定基础。方法根据pSectag2A多克隆位点、（G4S）3及scFv2F9基因序列，设计含有SfiI、EcoRI酶切位点、6×His以及终止密码TGA的引物，采用高保真的Taq酶，通过重叠延伸拼接法（splicing by overlap extension，SOE）扩增克隆到scFv2F9基因，将扩增到的目的基因片段克隆到pGEM T—easy载体，测序核实后再克隆到pSectag2A真核分泌型表达载体中。阳性重组质粒pSectag2A／scFv2F9转染中华仓鼠卵巢（CHO）细胞进行目的蛋白的瞬时表达，将培养上清浓缩后，流式细胞术观察其对亲本单抗的阻滞效果。结果真核分泌型表达载体pSectag2A／scFv2F9在CHO细胞中获得成功表达，其相对分子质量为31000。亲本直标单抗2F9-FITC被真核细胞表达的scFv2F9阻滞后其阳性细胞百分数、平均荧光强度和最高峰值分别下降了90．02％、63．30％和63．38％。结论克隆到的2F9V。和2F9VL基因及构建的真核分泌型表达载体pSectag2A／scFv2F9是正确的，scFv2F9在CHO细胞中获得成功的表达，且有较高的识别和结合人CD14抗原的功能。

关键词：单链抗体中华仓鼠卵巢(CHO)细胞 CD14 真核表达

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CAG方案在儿童急性髓系白血病中的应用

中华血液学杂志 2004年第6期25卷 383-384页

作者：宋华石淑文徐卫群汤永民杨世隆沈红强钱柏芹浙江大学医学院附属儿童医院杭州310003

我院于2001年4月～2002年10月用CAG[阿糖胞苷(Ara-C)、阿克拉霉素、G-CSF]方案治疗儿童急性髓系白血病(AML)6例(8例次),现报道如下。

关键词： CAG方案儿童急性髓系白血病 AML 造血生长因子

用移植物细胞模型评价CD_(34)^+细胞选择的效果

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中华儿科杂志 2002年第6期40卷 337-341页

作者：孙飞汤永民沈红强钱柏芹宋华杨世隆石淑文徐卫群浙江大学医学院附属儿童医院血液科

目的　用移植物细胞模型评价免疫磁珠法进行CD34 阳性细胞选择的效果。方法　用荧光素Calcein AM标记靶细胞后分别种入细胞株、骨髓 (BM)或外周血干 (祖 )细胞 (PBSC)中以建立模型 ;用免疫磁珠法对模型进行CD34 阳性细胞选择 ,以流式细... 详细信息

目的　用移植物细胞模型评价免疫磁珠法进行CD34 阳性细胞选择的效果。方法　用荧光素Calcein AM标记靶细胞后分别种入细胞株、骨髓 (BM)或外周血干 (祖 )细胞 (PBSC)中以建立模型 ;用免疫磁珠法对模型进行CD34 阳性细胞选择 ,以流式细胞仪 (FCM)进行选择前后的效果评价。结果　模型Ⅰ (靶细胞加细胞系 )、Ⅱ (靶细胞加BM)、Ⅲ (靶细胞加PBSC)经选择后CD+ 34 细胞纯度分别为(94 54± 0 93) %、(68 1 5± 2 3 53) %、(57 1 8± 9 2 3) % ;富集倍数分别为 7 9± 0 1、1 0 4± 4 0、8 2±1 3 ;回收率分别为 (2 7 6± 3 8) %、(44 4± 1 3 1 ) %、(66 4± 1 3 9) %。模型Ⅱ中肿瘤细胞的清除率为(1 82± 0 51 )个对数级 (log) ;模型Ⅲ中T细胞的清除率为 (2 48± 0 38)log。结论　移植物细胞模型能简便、准确、快速地评价CD34 阳性细胞选择时的富集和净化作用。免疫磁珠法进行CD34 阳性选择具有良好的CD+ 34

关键词：移植物细胞模型 CD34^+细胞选择 CD34抗原免疫磁珠法 T细胞恶性肿瘤肿瘤治疗肿瘤细胞造血干细胞移植

外周血和骨髓微量神经母细胞瘤细胞检测的临床意义

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中华小儿外科杂志 2003年第5期24卷 459-461页

作者：汤宏峰唐达星汤永民钱柏芹沈红强浙江大学医学院附属儿童医院外科杭州310003

目的探讨CD45/CD56/GD2单克隆抗体(单抗)流式细胞仪分析法检测周围血和骨髓微量神经母细胞瘤(NB)细胞的临床意义。方法 11例腹部神经母细胞瘤(NB组)和23例其他肿瘤(对照组)患儿,年龄6个月至12岁,用单抗CD45/CD56/GD2流式细胞术检测外... 详细信息

目的探讨CD45/CD56/GD2单克隆抗体(单抗)流式细胞仪分析法检测周围血和骨髓微量神经母细胞瘤(NB)细胞的临床意义。方法 11例腹部神经母细胞瘤(NB组)和23例其他肿瘤(对照组)患儿,年龄6个月至12岁,用单抗CD45/CD56/GD2流式细胞术检测外周血和骨髓穿刺标本微量NB细胞。结果 NB组入院时血和骨髓微量NB细胞阳性率分别为90.9％(10/11)和72.7％(8/11),对照组血和骨髓均为阴性(P<0.001)。NB组骨髓微量NB细胞检测与涂片细胞学检查阳性率有较好的相关性(P<0.05),但前者阳性率更高,不受骨髓稀释影响。骨髓NB细胞阳性率与临床分期有关,Ⅱ～Ⅳ期明显高于Ⅰ期(P<0.01)。化疗后血和骨髓NB细胞数均明显减少(P<0.05)。术后转移者血NB细胞重新出现阳性。结论 CD45/CD56/GD2单抗流式细胞术检测周围血和骨髓微量NB细胞具有高度敏感性和特异性,有助诊断、鉴别诊断、疗效观察和复发转移监测。

关键词：外周血骨髓微量神经母细胞瘤细胞检测临床意义单克隆抗体

新单抗ZCH-7-2D3与白血病细胞的反应性及其临床意义

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浙江大学学报（医学版） 2006年第4期35卷 390-393页

作者：郭莉汤永民沈红强钱柏芹宁铂涛张海忠张怡浙江大学医学院附属儿童医院血液肿瘤科浙江杭州310003

目的:观察新抗人白细胞分化抗原ZCH-7-2D 3单克隆抗体(单抗)与白血病细胞的反应性及其在白血病免疫学诊断分型中的意义。方法:采用CD 45设门和多色流式细胞术,对经30余种标准单抗业已定型的100例白血病患者新鲜的骨髓细胞或外周血标本... 详细信息

目的:观察新抗人白细胞分化抗原ZCH-7-2D 3单克隆抗体(单抗)与白血病细胞的反应性及其在白血病免疫学诊断分型中的意义。方法:采用CD 45设门和多色流式细胞术,对经30余种标准单抗业已定型的100例白血病患者新鲜的骨髓细胞或外周血标本进行流式细胞术分析。结果:2D 3抗原在急性淋巴细胞性白血病(ALL)病例中的阳性率(10/31)明显低于急性髓细胞性白血病(AM L)(39/55,P0.05)。结论:单抗2D 3主要与AM L细胞反应,但在识别白血病细胞分化阶段上未发现特殊性。

关键词：白血病单克隆抗体流式细胞术免疫分型