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抗CTLA-4嵌合抗体的制备及生物学活性鉴定

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现代免疫学 2012年第5期32卷 359-364页

作者：许静李晶杨扬郭怀祖钱卫珠张大鹏王皓第二军医大学肿瘤研究所上海200433

制备新型抗CTLA-4人鼠嵌合抗体并进行活性鉴定。通过杂交瘤技术获得高亲和力小鼠抗人CTLA-4单克隆抗体22G11和16C11;利用分子克隆技术将鼠源抗体可变区基因与人源抗体恒定区拼接后,最终通过CHO-K1工程株细胞表达高亲和力抗CTLA-4嵌合抗... 详细信息

制备新型抗CTLA-4人鼠嵌合抗体并进行活性鉴定。通过杂交瘤技术获得高亲和力小鼠抗人CTLA-4单克隆抗体22G11和16C11;利用分子克隆技术将鼠源抗体可变区基因与人源抗体恒定区拼接后,最终通过CHO-K1工程株细胞表达高亲和力抗CTLA-4嵌合抗体。经SDS-PAGE电泳显示最终获得了纯度高于90%的CTLA-4嵌合抗体c22G11和c16C11,抗原结合活性结果表明两株嵌合抗体都能很好地与Jurkat细胞结合,竞争抑制实验表明它们都能与各自对应的鼠源抗体竞争。据此,本实验获得了两株抗人CTLA-4胞外区的高亲和力和特异性嵌合抗体。

关键词： CTLA-4 单克隆抗体免疫原性 5’RACE技术嵌合抗体

生物薄膜干涉技术和ELISA法检测抗体药物免疫原性的方法学比较

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现代免疫学 2012年第4期32卷 282-286页

作者：衡磊王冲钱卫珠张大鹏王皓苏州大学医学生物技术研究所苏州215007 上海交通大学医学院上海200240 上海抗体药物国家工程研究中心上海201203 第二军医大学肿瘤研究所上海200433

采用生物薄膜干涉技术(BLI)开发快速检测治疗性单抗(抗EGFR单抗,Cetuximab)的抗抗体(ADAs)的检测方法。本研究利用ForteBio公司开发的Octet系统,在光纤制成的生物传感器底端覆盖生物分子相容层,偶联配体,形成生物膜层。当分析物结合传... 详细信息

采用生物薄膜干涉技术(BLI)开发快速检测治疗性单抗(抗EGFR单抗,Cetuximab)的抗抗体(ADAs)的检测方法。本研究利用ForteBio公司开发的Octet系统,在光纤制成的生物传感器底端覆盖生物分子相容层,偶联配体,形成生物膜层。当分析物结合传感器底端偶联的配体时,生物膜层厚度增加,反射光干涉光谱曲线产生可测量的漂移,从而可以实现对分子间相互作用的实时测量,同时以传统的抗体桥ELISA法作为平行对照。SA(Streptavidin)传感器结合生物素化的单抗,用免疫原性试剂孵育血清样品后,利用传感器检测血清样品的ADA。分别应用BLI和ELISA两种方法确定cutpoint,并进行剂量反应曲线的分析。研究结果表明BLI快速分析法具有同ELISA法极其相似的免疫原性检测行为,均能准确检测出筛选分析中的20例正常人血清的基线反应值。同时,BLI法在竞争抑制实验中体现出了很高的特异性。与ELISA相比,BLI技术用于治疗性抗体的临床免疫原性分析,更加省时,快捷,准确,而且可避免低亲和力ADA易受洗板干扰的弊端。因此,BLI技术可能成为抗体药物免疫原性检测的一种新的有效方法。

关键词：西妥昔单抗 EusA 生物薄膜干涉技术抗抗体检测

pGFP-FL质粒的构建及其在FL基因修饰性肿瘤疫苗中的应用

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第一军医大学学报 2002年第7期22卷 592-595页

作者：卢洋钱卫珠王皓吴孟超郭亚军薛琪第二军医大学肿瘤研究所东方肝胆外科医院上海200433 第一军医大学南方医院普外科广东广州510515

目的　构建一个含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因,并能够用于Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体（FL）基因修饰性肿瘤疫苗研究的质粒载体。方法　利用常规分子生物学方法设计并构建含有一个FL基因和一个GFP基因的pGFP-FL质粒。在该质粒中,以... 详细信息

目的　构建一个含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因,并能够用于Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体（FL）基因修饰性肿瘤疫苗研究的质粒载体。方法　利用常规分子生物学方法设计并构建含有一个FL基因和一个GFP基因的pGFP-FL质粒。在该质粒中,以CMV启动子驱动FL基因,同时以肽链延长因子（EF-1α）启动子驱动GFP基因,并引入原核和真核选择基因KanR/neo。对所获得的pGFP-FL质粒以限制性内切酶酶切鉴定后,再将其导入Hepa1-6细胞内,直接在荧光显微镜下观察GFP基因的表达情况,同时以RT-PCR和PCR产物测序的方法对GFP阳性细胞内FL基因的表达进行检测。结果　质粒的酶切鉴定结果表明所构建的pGFP-FL与预期的结构一致,FL和GFP两者能同时在Hepa1-6细胞内表达。结论　本研究构建了一种新型的FL基因修饰肿瘤疫苗研究载体,位于该载体上的GFP的表达能够反映FL基因的转录表达情况,可以作为FL基因表达的报告基因。

关键词： FL基因肿瘤疫苗分子生物学质粒载体 pGFP-FL质粒

抗CD3人源化抗体恒定区突变体的体外生物学特性研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第8期23卷 584-587页

作者：李博华王皓杨扬钱卫珠季军捷王荣福郭亚军第二军医大学肿瘤研究所

目的　研究抗CD3人源化抗体hu12F6的恒定区突变体hu12F6m的体外生物学活性。方法　通过细胞因子释放分析及早期活化标志分子的检测对hu12F6m的T细胞活化性质进行评价 ;通过体外抗原调变实验考察hu12F6m对T细胞的抑制功能。结果　hu12F6... 详细信息

目的　研究抗CD3人源化抗体hu12F6的恒定区突变体hu12F6m的体外生物学活性。方法　通过细胞因子释放分析及早期活化标志分子的检测对hu12F6m的T细胞活化性质进行评价 ;通过体外抗原调变实验考察hu12F6m对T细胞的抑制功能。结果　hu12F6m激活T细胞释放TNF α、IFN γ、IL 10等细胞因子及表达早期活化标志CD6 9分子的水平明显低于hu12F6 ,但其调变CD3抗原的能力保持与hu12F6相似。结论　hu12F6m对T细胞的激活作用显著减弱并保留了对T细胞的抑制功能 ,有望成为一种抗排异能力强、免疫原性和毒副作用小的有效免疫抑制剂。

关键词： CD3 人源化抗体免疫抑制剂抗原调变 hul2F6m

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比那地尔与肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡

第二军医大学学报 2004年第1期25卷 93-95页

作者：姚小鹏李强钱卫珠黄怡白冲董宇超刘忠令第二军医大学长海医院呼吸内科上海200433 科研部国际合作肿瘤研究所

目的 :研究钾通道开放剂比那地尔 (Pin)对大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖和凋亡的作用。方法 :通过非核素标记细胞增殖检测、3H- Td R掺入、形态学、流式细胞术等方法研究 Pin对大鼠 PASMC增殖和凋亡的作用。结果 :2 5～ 5 0 0μm o... 详细信息

目的 :研究钾通道开放剂比那地尔 (Pin)对大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖和凋亡的作用。方法 :通过非核素标记细胞增殖检测、3H- Td R掺入、形态学、流式细胞术等方法研究 Pin对大鼠 PASMC增殖和凋亡的作用。结果 :2 5～ 5 0 0μm ol/ L 的 Pin呈剂量依赖性地减少大鼠 PASMC的细胞数和 DNA合成 ,5 0 0 μm ol/ L 的 Pin显著减少 S期和 G2 / M期的细胞比例 ,增加 G0 / G1 期细胞的比例。 5 0～ 5 0 0 μm ol/ L 的 Pin呈剂量依赖性地增加大鼠 PASMC的凋亡率。结论 :钾通道开放剂抑制大鼠 PASMC增殖并促进其凋亡。

关键词：比那地尔肺动脉平滑肌细胞细胞增殖细胞凋亡钾通道开放剂大鼠

一氧化氮对肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡作用的研究

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第二军医大学学报 2002年第9期23卷 999-1002页

作者：姚小鹏王皓李强钱卫珠黄怡白冲董宇超刘忠令第二军医大学长海医院呼吸内科上海200433 第二军医大学国际肿瘤研究所

目的 :研究一氧化氮 (NO)对肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖和凋亡的作用。方法 :通过非核素标记细胞增殖检测试剂盒、3 H- Td R掺入、形态学、流式细胞术等方法研究 NO与 PASMC增殖和凋亡的关系。结果 :2 5～ 5 0 0μm ol/L的 NO供体 S... 详细信息

目的 :研究一氧化氮 (NO)对肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖和凋亡的作用。方法 :通过非核素标记细胞增殖检测试剂盒、3 H- Td R掺入、形态学、流式细胞术等方法研究 NO与 PASMC增殖和凋亡的关系。结果 :2 5～ 5 0 0μm ol/L的 NO供体 S-亚硝基乙酰青霉胺 (SNAP)呈剂量依赖性地减少 PASMC的细胞数和 DNA合成 ,5 0 0μm ol/L的 SNAP显著减少 S期和G2 /M期的细胞比例 ,增加 G0 /G1 期的细胞比例。 10 0～ 5 0 0μmol/L的 SNAP呈剂量依赖性地增加 PASMC的凋亡率。结论 :NO可抑制 PASMC增殖并促进其凋亡。早期给予

关键词：肺动脉高压一氧化氮肺动脉平滑肌细胞增殖细胞凋亡

自然杀伤细胞的独立刺激信号——CD45分子交联

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第二军医大学学报 1998年第4期19卷 311-313页

作者：沈锋王皓谢天培郭亚军吴孟超陈汉钱卫珠第二军医大学东方肝胆外科医院

目的：探讨表面分子在自然杀伤（ＮＫ）细胞活化中的信号分子作用及其机制。方法：采用多种粘附分子单抗及配体刺激ＮＫ细胞，ＥＬＩＳＡ法定量检测刺激后ＮＫ细胞释放的γ干扰素（ＩＦＮ－γ）作为ＮＫ细胞活化指标，观察各种粘附分子... 详细信息

目的：探讨表面分子在自然杀伤（ＮＫ）细胞活化中的信号分子作用及其机制。方法：采用多种粘附分子单抗及配体刺激ＮＫ细胞，ＥＬＩＳＡ法定量检测刺激后ＮＫ细胞释放的γ干扰素（ＩＦＮ－γ）作为ＮＫ细胞活化指标，观察各种粘附分子在ＮＫ细胞释放ＩＦＮ－γ中的信号作用。结果：单一ＣＤ４５单抗刺激即可使ＮＫ细胞活化；两种分别为ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ亚类的ＣＤ４５单抗及ＩｇＧ２ａ亚类ＣＤ４５单抗的Ｆ（ａｂ）２均体现对ＮＫ细胞的独立刺激作用。结论：ＣＤ４５分子介导的ＮＫ细胞活化与ＣＤ１６－Ｆｃ段间相互作用无关。

关键词：杀伤细胞粘附分子信号传递 CD45分子交联

抗CD20人源化抗体的制备及生物学活性鉴定

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现代免疫学 2009年第6期29卷 491-496页

作者：杨扬张大鹏吴兰郭怀祖聂丽钱卫珠王皓李博华第二军医大学肿瘤研究所上海200433 抗体药物国家工程研究中心上海201203

在前期实验中,我们制备了一株抗CD20的嵌合抗体c8F6并证实其可有效杀伤CD20阳性的B淋巴瘤细胞。为了进一步降低c8F6的免疫原性,在研究中我们采用同源模建的方法模拟8F6的三维结构,通过分析其空间结构,确定可能影响抗体与抗原结合的框架... 详细信息

在前期实验中,我们制备了一株抗CD20的嵌合抗体c8F6并证实其可有效杀伤CD20阳性的B淋巴瘤细胞。为了进一步降低c8F6的免疫原性,在研究中我们采用同源模建的方法模拟8F6的三维结构,通过分析其空间结构,确定可能影响抗体与抗原结合的框架区(FR)氨基酸残基,然后将鼠源抗体互补决定区(CDR)和FR区的关键氨基酸移植到人源模板上,构建出人源化抗体hu8F6。此人源化抗体除CDR区外,仅含有11个鼠源残基,但具有与嵌合抗体相似的亲和力和特异性。体外生物学功能实验进一步表明,hu8F6具有与c8F6相似的补体依赖的细胞溶解作用(CDC)和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC),可有效杀伤人B淋巴瘤细胞Raji和Daudi,提示hu8F6有望发展成为一个用于B淋巴瘤治疗的低免疫原性抗体制剂。

关键词：人源化免疫原性同源模建单克隆抗体 8F6

肝癌特异性细胞毒 T 淋巴细胞的实验及临床研究

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中华外科杂志 1997年第2期35卷 95-99页

作者：沈锋王皓谢天培施乐华钱卫珠刘新垣吴孟超郭亚军第二军医大学东方肝胆外科医院中科院上海生物化学研究所

诱导肿瘤特异性细胞毒性Ｔ细胞（ＴＳ－ＣＴＬｓ），观察其体外、体内的抗肿瘤作用及其特异性；评价其抗肝癌术后复发的临床应用价值。方法：用细胞因子体外短期刺激方法提高肝癌细胞的免疫原性，再与肿瘤浸润Ｔ细胞共同培养，辅以ＣＤ... 详细信息

诱导肿瘤特异性细胞毒性Ｔ细胞（ＴＳ－ＣＴＬｓ），观察其体外、体内的抗肿瘤作用及其特异性；评价其抗肝癌术后复发的临床应用价值。方法：用细胞因子体外短期刺激方法提高肝癌细胞的免疫原性，再与肿瘤浸润Ｔ细胞共同培养，辅以ＣＤ２８单抗共刺激，诱导ＴＳ－ＣＴＬｓ，检测其体内外抗肝癌作用及其效应机制；大量扩增后回输患者，观察其免疫学指标的变化并随访其术后复发情况。结果：体外研究表明，肝癌细胞经ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α诱导后ＭＨＣＩ类分子，ＩＣＡＭ－１及Ｂ７分子的表达增高，用此细胞辅以ＣＤ２８单抗刺激诱导产生的ＴＳ－ＣＴＬｓ体现了高度的对自体肝癌的杀伤活性及特异性，其杀伤活性由ＴＣＲ－ＣＤ３复合物、ＣＤ８、ＬＦＡ－１、ＩＣＡＭ－１及ＭＨＣＩ类分子所介导。体内研究的结果表明，ＴＳ－ＣＴＬｓ对ＳＣＩＤ小鼠人肝癌模型具有显著的抑瘤作用。１２例初步临床应用的结果表明，ＴＳ－ＣＴＬ对于提高机体的Ｔ细胞免疫功能，对于预防肝癌术后复发均具有良好作用，值得进一步深入研究和应用。结论：ＴＳ－ＣＴＬｓ作为一种新的肿瘤特异性免疫治疗方法可望进一步提高肝癌和其它实体肿瘤的外科综合治疗水平。

关键词：肝肿瘤 T淋巴细胞细胞毒性免疫疗法