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OVA-接头-β2m融合基因的构建及体内特异性CTL的诱导(英文)

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第5期34卷 547-552页

作者：钱丽钱关祥上海第二医科大学分子生物学实验中心上海200025 上海第二医科大学分子生物学实验中心

构建融合基因OVA 接头 β2m的表达载体 ,通过接头 (linker)序列使 β2微球蛋白 (β2m)与肽段共价结合 ,限制其在体内的扩散 ,以期获得更具潜力的免疫原结构。采用PCR技术 ,从人肝癌细胞株SMMC 772 1中克隆人 β2m基因 ,拼接上卵白蛋白 ... 详细信息

构建融合基因OVA 接头 β2m的表达载体 ,通过接头 (linker)序列使 β2微球蛋白 (β2m)与肽段共价结合 ,限制其在体内的扩散 ,以期获得更具潜力的免疫原结构。采用PCR技术 ,从人肝癌细胞株SMMC 772 1中克隆人 β2m基因 ,拼接上卵白蛋白 (OVA) (2 5 7— 2 6 4 )序列及接头后 ,克隆入 pET 4 2b(+)高效表达载体进行诱导表达。对表达产物进行纯化与复性后 ,用其作为免疫原诱导特异性CTL ,并构建H 2Kb 四聚体检测特异性CTL。应用H 2Kb 四聚体对特异性CTL检测结果与经典的细胞毒试验一致 ,同时对胞外IFN γ进行了定量检测。结果表明 ,OVA 接头 β2m的表达产物可有效诱导体内特异性CTL反应 ,在体外构建MHC I类分子四聚体 ,为特异性T细胞的检测提供了有利的工具

关键词：四聚体基因表达纯化复性 CTL

重组牛痘病毒介导的微小基因表达产物OVA257～264在真核细胞中的抗原呈递效率

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第6期34卷 719-724页

作者：钱丽钱关祥上海第二医科大学生物化学教研室、分子生物学实验室上海200025 上海第二医科大学生物化学教研室、分子生物学实验室

应用含重组OVA微小基因及全长基因的牛痘病毒感染能够稳定表达Kb 分子的多种真核细胞 ,通过构象特异的单克隆抗体 2 5 .D 1.16 (anti OVA2 57～ 2 64/Kb)检测细胞表面复合物的形成情况 ,并借助四聚体技术检测了它们对抗原特异性T细胞的... 详细信息

应用含重组OVA微小基因及全长基因的牛痘病毒感染能够稳定表达Kb 分子的多种真核细胞 ,通过构象特异的单克隆抗体 2 5 .D 1.16 (anti OVA2 57～ 2 64/Kb)检测细胞表面复合物的形成情况 ,并借助四聚体技术检测了它们对抗原特异性T细胞的诱导能力。结果表明四聚体的构建是成功的 ,进一步用已被重组牛痘病毒感染的L92 9 Kb 细胞作为抗原呈递细胞以诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的产生 ,并对活化后特异性CTL进行检测 ,从胞外IFN γ的分泌情况看 ,诱导后的整个群体细胞发生了活化与增殖 ,H 2Kb OVA四聚体对特异性T细胞进行的结合分析与经典的细胞毒效应相一致。可见 ,重组牛痘病毒介导的微小基因产物OVA2 57～ 2 64不仅能为MHC I类分子的合成提供更有效的肽来源 ,且能更有效诱导特异性CTL的产生。

关键词：四聚体重组牛痘病毒微小基因 CTL 抗原肽

sOVA-linker-β2m融合蛋白构建表位特异的靶结构

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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第5期23卷 345-349页

作者：钱丽张兴黔钱关祥上海第二医科大学生物化学教研室 200025

目的　构建融合基因sOVA linker β2m ,探讨通过内源性途径递呈的肽在细胞表面形成MHCⅠ类分子复合物的情况。方法　构建了真核表达载体pcDNA3/sOVA linker β2m及不含有 β2m基因的对照载体 ,以研究 β2m是否能在此过程中起到辅助的作... 详细信息

目的　构建融合基因sOVA linker β2m ,探讨通过内源性途径递呈的肽在细胞表面形成MHCⅠ类分子复合物的情况。方法　构建了真核表达载体pcDNA3/sOVA linker β2m及不含有 β2m基因的对照载体 ,以研究 β2m是否能在此过程中起到辅助的作用。结果　RT PCR与原位杂交结果显示在各转导细胞中均有融合基因的正确表达 ,且二者的表达水平差异无显著性 (P >0 .0 5 )。进一步对细胞内、细胞表面H 2Kb OVA复合物的分布进行分析 ,表明各转导细胞中均有正确的蛋白质分子翻译合成 ,并能表达在细胞表面 ,但融合有 β2m基因的EL4 /eb2m细胞的表达量远远高于没有融合 β2m基因的转导细胞EL4 /OVA。结论　β2m基因与特异性抗原肽的融合 ,易于形成稳定的MHCⅠ类分子复合物 ,提高抗原呈递效率。

关键词： β2m基因 MHCⅠ类分子基因表达卵清白蛋白

OVA_(257-264)肽-β2m融合基因的构建及体内特异性CTL的诱导

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细胞与分子免疫学杂志 2002年第5期18卷 439-442,446页

作者：钱丽钱关祥上海第二医科大学分子生物学实验中心上海200025

目的　构建融合基因OVA2 57 2 64 β2m的表达载体 ,并以其表达产物作为免疫原 ,在体内诱导特异性CTL。方法　采用PCR技术 ,从人肝癌细胞株SMMC 772 1中克隆人β2m基因 ,拼接上OVA(2 5 7～ 2 6 4)序列及linker后 ,克隆入pET 42b(+)高效... 详细信息

目的　构建融合基因OVA2 57 2 64 β2m的表达载体 ,并以其表达产物作为免疫原 ,在体内诱导特异性CTL。方法　采用PCR技术 ,从人肝癌细胞株SMMC 772 1中克隆人β2m基因 ,拼接上OVA(2 5 7～ 2 6 4)序列及linker后 ,克隆入pET 42b(+)高效表达载体进行诱导表达。对表达产物进行纯化与复性后 ,用其作为免疫原诱导特异性CTL ,并构建H 2Kb OVA四聚体检测特异性CTL。结果　成功地获得融合蛋白OVA2 57 2 64 β 2m及H 2Kb OVA四聚体 ,应用H 2Kb OVA四聚体对特异性CTL检测结果与经典的细胞毒试验一致。结论　OVA2 57 2 64 β 2m的表达产物 ,可有效的在体内诱导特异性CTL应答。在体外构建的MHCI类分子四聚体。

关键词：四聚体表达纯化特异性CTL PCR技术多肽疫苗

Tumor cell-specific gene transfer with retroviral vectors displaying single-chain antibody

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Chinese Medical Journal 2002年第7期115卷 1064-1069,153页

作者：汤宇澄李煜钱关祥 Department of Biochemistry and Molecular Biology the Researeh Center for Human Gene TherapyShanghai Second Medical UniversityShanghai 200025China

OBJECTIVE: To specifically deliver the therapeutic gene to cancer cells and construct target retroviral vectors by inserting the single-chain variable antibody fragment into the retroviral envelope. METHODS: Single-chain antibody expression vector pET -20bScfv was constructed. Binding activity of the genetically engineered single-chain variable antibody fragment was verified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blot. At the same time, by means of polymerase chain reaction (PCR)-directed mutagenesis, the appropriate cloning site EcoT22/Sal was generated at the N-terminus of receptor-binding SU domain in the MoMLV env polypeptide. Then the single- chain antibody gene, encoding a functional antibody, was inserted into the cloning site. The Scfv-env fusion gene fragment was subcloned into CMV expression vector. The Lac-Z retrovirus that co-displayed the Scfv-env chimeric protein and wild-type env protein was produced by transfection of Psi 2 cells with retroviral plasmid and the fusion gene expressing *** confirm the specificity of the recombinant retrovirus, infection assays and competitive inhibition assays were performed. RESULTS: The results of ELISA and Western blot showed that the genetically engineered single-chain variable antibody fragment could bind to the SHG44 cells surface membrane antigen. Virus-binding assay, viral infection and competitive inhibition assays confirmed that the harvested virus efficiently bound to and infected SHG44 cancer cells expressing the relative membrane antigen specially via the recognition of the target antigen. CONCLUSION: These results imply that insertion of Scfv into the retroviral envelope can specifically deliver the interested gene into specific antigen-producing cancer cells.

关键词： Gene Therapy Gene Transfer Techniques Genetic Vectors Hela Cells Humans Immunoglobulin Fragments Neoplasms Research Support, Non-U.S. Gov't Retroviridae

白血病免疫分型与免疫球蛋白和T细胞受体基因重排的研究

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中华血液学杂志 1992年第3期13卷 141-143页

作者：林梓钱关祥 200092 上海第二医科大学

应用单克隆抗体对34例白血病细胞进行了免疫分型与形态分型比较，发现有4例形态与免疫分型不一致，而分子生物学免疫球蛋白（Ig)基因和T细胞受体（TcR)基因重排，均支持免疫分型，说明免疫分型比形态分型更为确切。分子生物学的分析更... 详细信息

应用单克隆抗体对34例白血病细胞进行了免疫分型与形态分型比较，发现有4例形态与免疫分型不一致，而分子生物学免疫球蛋白（Ig)基因和T细胞受体（TcR)基因重排，均支持免疫分型，说明免疫分型比形态分型更为确切。分子生物学的分析更进一步补充了免疫分型的不足之处。7例免疫分型为未分化型细胞均出现Ig重链或轻链基因重排而被肯定为B细胞型。本组还发现2例T及B双标记细胞。但TcR重排比较复杂，常与Ig重排有交叉现象，还必须应用TcR表达（RNA）来作进一步分析。

关键词：白血病免疫分型 T细胞

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人β2m基因的克隆及表达

细胞与分子免疫学杂志 2001年第4期17卷 384-385页

作者：钱丽钱书兵钱关祥上海第二医科大学分子生物学实验中心上海200025

β2m是含有99个氨基酸的血清蛋白，也是构成MHC-I类分子的亚单位。最初从肾脏患者的尿液中分离得到[1]，其表达异常与多种肿瘤及肝、肾疾病有密切关系。HLA-A2的晶体结构已证实,α3和β2m折叠起来形成Ig样功能区[2],并表明β2m对维持I... 详细信息

β2m是含有99个氨基酸的血清蛋白，也是构成MHC-I类分子的亚单位。最初从肾脏患者的尿液中分离得到[1]，其表达异常与多种肿瘤及肝、肾疾病有密切关系。HLA-A2的晶体结构已证实,α3和β2m折叠起来形成Ig样功能区[2],并表明β2m对维持I类分子的天然构型的稳定性及其表达起关键作用[3，4]。MHC-I类分子在免疫系统中占有极其重要的地位，目前已趋向利用基因工程技术构建MHC-I类分子复合物以克服从体内获得的困难[5,6]。本研究成功地构建了其轻链β2m的融合表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达。1 材料和方法1.1 材料*** C600及人肝癌细胞株SMMC-7721均为本室

关键词： RT-PCR 人β2m 基因表达基因克隆

H-2K^b-BSP融合基因在大肠杆菌中的表达与纯化

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细胞与分子免疫学杂志 2002年第1期18卷 30-32页

作者：钱丽钱书兵钱关祥上海第二医科大学分子生物学实验中心上海200025

目的构建可生物素化Ｈ－２Ｋ～ｂ－ＢＳＰ融合基因的表达载体。方法采用ＰＣＲ技术，从ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）Ｋ～ｂ中扩增出Ｈ－２Ｋ～ｂ基因的胞外区，拼接上依赖ＢｉｒＡ酶的可生物素化序列后，克隆人ｐＥＴ－４２ｂ... 详细信息

目的构建可生物素化Ｈ－２Ｋ～ｂ－ＢＳＰ融合基因的表达载体。方法采用ＰＣＲ技术，从ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）Ｋ～ｂ中扩增出Ｈ－２Ｋ～ｂ基因的胞外区，拼接上依赖ＢｉｒＡ酶的可生物素化序列后，克隆人ｐＥＴ－４２ｂ（＋）高效表达载体进行诱导表达。并对表达产物进行纯化与复性。结果成功地构建了融合表达载体ｐＥＴ－Ｈ－２Ｋ～ｂ－ＢＳＰ，对表达产物进行纯化与复性，并应用仅识别完整构象的抗Ｋ～ｂ分子的单克隆抗体对复性后产物进行了检测。证明表达产物已部分恢复了构象。结论获得Ｈ－２Ｋ～ｂ－ＢＳＰ融合蛋白的高效表达，为研究在原核系统中表达、纯化与复性，以及进一步利用亲和素在体外构建ＭＨＣ－Ｉ类分子四聚体，探讨免疫识别机制奠定了基础。

关键词： H-2K^b 基因表达纯化复性

人β2微球蛋白基因启动子的克隆及其在P815细胞中的活性研究

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第6期21卷 672-675页

作者：张兴黔梅文瀚钱关祥上海第二医科大学生物化学教研室及分子生物学实验室人类基因治疗研究中心上海200025

目的:克隆人β2微球蛋白(β2m)基因启动子,并研究其在小鼠肥大细胞瘤细胞P815中对下游报告基因的启动活性。方法:用PCR法从基因组内扩增β2m基因启动子。通过基因重组的方法,构建含此启动子的EGFP基因真核表达载体,然后分别瞬时和稳定转... 详细信息

目的:克隆人β2微球蛋白(β2m)基因启动子,并研究其在小鼠肥大细胞瘤细胞P815中对下游报告基因的启动活性。方法:用PCR法从基因组内扩增β2m基因启动子。通过基因重组的方法,构建含此启动子的EGFP基因真核表达载体,然后分别瞬时和稳定转染P815细胞。通过RT-PCR、荧光显微镜摄像和流式细胞术分析,观察IFN-γ作用前后EGFP的表达。结果:从基因组内扩增出302bp的人β2m基因的启动子,成功地构建了含此启动子的真核报告载体。RT-PCR的结果表明,IFN-γ对启动子的活性具有诱导作用,且呈浓度依赖性。流式细胞术的结果显示,在5×105U/LIFN-γ作用下,尽管表达EGFP的细胞数量没有差异,但刺激组EGFP的表达强度是未刺激组的2倍。结论:人β2m基因启动子在小鼠肥大细胞瘤细胞P815中具有高度的启动活性。通过该启动子中所含干扰素刺激反应元件(ISRE),可在IFN-γ诱导作用下调控下游目的基因的表达。

关键词： β2微球蛋白启动子 IFN-1