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高压氧对创伤性休克复苏后大鼠肠道的影响

高压氧对创伤性休克复苏后大鼠肠道的影响

作者：金立方中国医科大学

学位级别：硕士

目的目前关于失血性休克胃肠缺血再灌注损伤的机制的学说很多,但是尚未得到彻底的阐明。本研究的目的就是观察高压氧治疗对创伤性休克复苏后大鼠肠道缺血-再灌注损伤的影响并探讨其作用机制。材料与方法一、动物分组健康Wistar大白鼠96... 详细信息

目的目前关于失血性休克胃肠缺血再灌注损伤的机制的学说很多,但是尚未得到彻底的阐明。本研究的目的就是观察高压氧治疗对创伤性休克复苏后大鼠肠道缺血-再灌注损伤的影响并探讨其作用机制。材料与方法一、动物分组健康Wistar大白鼠96只,体重260～300g,雌雄不限,由中国医科大学实验动物中心提供,随机分成四组,每组24只大鼠:对照组(只进行手术操作,不诱导休克);休克组(手术操作诱导休克并进行常规补血、补液复苏);高压氧一次组(休克组+复苏后立即一次高压氧治疗);高压氧三次组(休克组+二十四小时内三次高压氧治疗)。二、创伤性休克复苏动物模型的建立大白鼠麻醉成功后平卧固定,手术暴露血管,右股动脉插入套管针,连接血压换能器并与多参数监护仪相连,监测血压;左颈内静脉插入套管针作为复苏通路;右颈总动脉也插入套管针,用来进行放血。用铁块从高处垂直落下砸中左侧大腿,造成股骨骨折和肌肉组织挤压伤。同时通过右颈动脉插管放血,使血压下降造成休克。休克状态60分钟后,将全部放出的自体血经左颈内静脉回输,同时用生理盐水复苏60分钟。复苏后使平均动脉压维持于70～80mmHg以上。三、高压氧的实施将大鼠放入氧舱后,先洗舱三次,然后将舱内治疗压力匀速升至0.15MPa且氧浓度大于99.5%,维持恒定的舱内压力和氧浓度共60分钟。最后等速减压,舱内压力为0MPa后取出大鼠。四、观察指标及取材休克前、休克后、复苏前、及24小时后作为四个观察时间点,根据这四个时间点将第一部分每组的大鼠再分为四个亚组,每组6只。每个亚组的大鼠按照其对应的时间点活时剖腹,于回盲部用移液管滴注2.5%的戊二醛,于滴注戊二醛的部位取全层的小肠组织约0.5厘米,迅速放于冰块上,再次滴注2.5%戊二醛,然后于冰块上进行清洗,修剪。修成1个立方毫米,立即放入2.5%戊二醛中,留送电镜检查。于回盲部近端(避开滴注戊二醛的部位)取小肠组织块(0.2克-1.0克)后处死,取得的肠在冷生理盐水(0℃-4℃)中漂洗,除去血液,滤纸吸干,称重,放入5ml的小烧杯中,用移液管量取冷的生理盐水,生理盐水的体积应该是组织块重量的9倍,尽快剪碎组织块,然后用Snoiprep150型超声波发生器,以振幅14微米超声处理30秒,使细胞粉碎,制备成10%的肠道组织匀浆,匀浆离心后取上清,—70℃冻存待测。放免法检测肠道组织匀浆TNF-α。比色法检测肠道组织匀浆一氧化氮(NO)。比色法检测肠道组织匀浆诱生型一氧化氮合酶(iNOS)。比色法检测肠道组织匀浆乳酸含量。以上所有指标检测均按试剂盒说明书进行操作。五、组织病理学检查四个组的大鼠在24小时后活杀取标本,留取末端回肠4%福尔马林液固定,经脱水浸蜡包埋,切成3μm薄片,经伊红—苏木紫染色,常规病理学光镜检查,并进行病理评分。六、电镜超微结构观察将2.5%戊二醛中固定的样品,投入PH 7.4的PBS(磷酸缓冲液)中漂洗,放入PBS配制的1%OsO4(锇酸)固定液中后固定.乙醇丙酮梯度脱水,环氧树脂EPON812包埋,LKB超薄切片机切片,厚度500A0,铀铅双染色。JEM-100CX透射电镜下观察。七、统计学分析用SPSS13.0 For Windows软件处理数据。生化指标和病理评分的数据以均数±标准差((?)±s)表示,采用单因素方差分析(One-Way analysis of Variance,One-WayANOVA)检验,组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。结果一、肠道组织乳酸含量变化24小时后休克组、高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆乳酸含量均显著高于对照组(P＜0.05),高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆乳酸含量均显著低于休克组(P＜0.05)。高压氧三次组低于高压氧一次组,两者间差异不显著(P＞0.05)二、肠道组织TNF-α含量变化24小时后休克组、高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆TNF-α含量均显著高于对照组(P＜0.05),高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆TNF-α含量均显著低于休克组(P＜0.05)。高压氧三次组略低于高压氧一次组,差异不显著(P＞0.05)三、肠道组织iNOS活性变化24小时后休克组、高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆iNOS活性值均显著高于对照组(P＜0.05),高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆iNOS活性值均显著低于休克组(P＜0.05)。高压氧三次组略低于高压氧一次组,两者间差异不显著(P＞0.05)四、肠道组织NO含量变化24小时后休克组、高压氧一次和三次

关键词：高压氧创伤性休克复苏肠道超微结构

高压氧防止创伤／失血性休克复苏后大鼠肠道缺血-再灌注损伤

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中华急诊医学杂志 2009年第11期18卷 1183-1189页

作者：金立方王为成王钢中国医科大学附属第一医院急诊科沈阳110001

目的观察高压氧（HBO）对创伤／失血性休克复苏后大鼠肠道缺血-再灌注损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法Wistar大鼠用铁块砸击左侧股骨并同时通过右颈动脉放血建立创伤／失血性休克模型，随后进行自体血和液体复苏。大鼠随机分成... 详细信息

目的观察高压氧（HBO）对创伤／失血性休克复苏后大鼠肠道缺血-再灌注损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法Wistar大鼠用铁块砸击左侧股骨并同时通过右颈动脉放血建立创伤／失血性休克模型，随后进行自体血和液体复苏。大鼠随机分成对照组、休克组、HBO一次和三次治疗组。结果复苏24h后HBO一次和三次组大鼠肠道组织乳酸含量、诱生型一氧化氮合成酶（iNOS）活性、一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平均明显低于休克组（P〈0．05）；HBO一次和三次组中肠组织病理损伤评分明显低于休克组（P〈0．05）。电镜显示休克组肠黏膜上皮细胞肿胀，微绒毛广泛脱落；线粒体肿胀，嵴消失，形成空泡，广泛线粒体溶解；桥粒连接稀疏，细胞间紧密连接开放。HBO一次和三次组上述改变明显减轻：线粒体部分溶解，嵴部分消失，紧密连接得以保存。HBO三次组在以上所有的指标中均要好于HBO一次组，但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论HBO可以减少创伤性休克后肠道组织炎性细胞因子的产生，减轻炎症反应，保护肠道组织和黏膜屏障免受创伤／失血性休克后缺血／再灌注的损伤。

关键词：高压氧缺血-再灌注黏膜屏障

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六价铬的细胞毒理效应及其机制研究进展

中国细胞生物学学报 2013年第3期35卷 387-392页

作者：金立方袁翊朦胡祎瑞倪坚绍兴文理学院生命科学学院绍兴312000

六价铬[Cr(VI)]是一种普遍存在于土壤、大气与水环境中的污染物,可通过呼吸道、消化道及皮肤接触进入人体,产生直接或间接的毒性作用。该文着眼于近年来的研究进展,从Cr(VI)导致胞内活性氧累积效应、诱发细胞凋亡、导致细胞癌变、毒理... 详细信息

六价铬[Cr(VI)]是一种普遍存在于土壤、大气与水环境中的污染物,可通过呼吸道、消化道及皮肤接触进入人体,产生直接或间接的毒性作用。该文着眼于近年来的研究进展,从Cr(VI)导致胞内活性氧累积效应、诱发细胞凋亡、导致细胞癌变、毒理效应的基因组学研究等几方面,论述了Cr(VI)对人体和动物的细胞毒理效应及其作用机制。随着研究的深入,从基因组水平研究Cr(VI)毒理效应成为新的热点。

关键词：六价铬细胞毒理活性氧凋亡癌变

体外培养猕猴穆勒细胞经诱导可表现出视网膜前体细胞特征

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Zoological Research 2011年第6期32卷 611-616页

作者：郭祥玉金立方纪少珲魏强牛昱宇季维智中国科学院昆明动物研究所灵长类研究中心云南省动物生殖生物学重点实验室云南昆明650223

近年来的研究发现,鸡、大鼠和人视网膜中的穆勒胶质细胞(muller cell)在一定条件下,可显示出视网膜干/前体细胞的功能。但是,有关人类近亲猕猴穆勒细胞的研究尚未见报道。该研究首先使用基础培养基(DMEM+10%FBS)建立猕猴的穆勒细胞系,... 详细信息

近年来的研究发现,鸡、大鼠和人视网膜中的穆勒胶质细胞(muller cell)在一定条件下,可显示出视网膜干/前体细胞的功能。但是,有关人类近亲猕猴穆勒细胞的研究尚未见报道。该研究首先使用基础培养基(DMEM+10%FBS)建立猕猴的穆勒细胞系,其表达GS、vimentin、CRALBP和EGFR等穆勒细胞标记,不表达GFAP,与人的穆勒细胞基因表达相似而与啮齿类差异较大。穆勒细胞经神经干细胞培养基培养一周后可表达pax6、nestin、sox2、otx2、six6和six3等视网膜干细胞标记,继续使用视黄酸诱导,部分细胞可分化为神经元细胞,这说明猕猴的穆勒细胞在体外诱导条件下,可去分化为视网膜前体细胞,有望成为视网膜疾病细胞替代疗法的一种细胞来源。

关键词：猕猴视网膜干细胞穆勒细胞视网膜疾病

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一氧化氮在出血性休克中的作用机制

中国老年学杂志 2008年第16期28卷 1662-1663,F0004页

作者：董以泉金立方辛铭金东辉武警吉林省总队医院吉林长春130062

一氧化氮（NO）是一种自由基，由一氧化氮合酶（NOS）从左旋精氨酸胍合成。一氧化氮合酶（NOS）目前确定有三种同功酶（NOS1、NOS2、NOS3）。NO自由基在出血性休克时可以大量产生，并且在出血性休克中起着极其重要的作用。本文就近年来N... 详细信息

一氧化氮（NO）是一种自由基，由一氧化氮合酶（NOS）从左旋精氨酸胍合成。一氧化氮合酶（NOS）目前确定有三种同功酶（NOS1、NOS2、NOS3）。NO自由基在出血性休克时可以大量产生，并且在出血性休克中起着极其重要的作用。本文就近年来NO在出血性休克中的作用机制进行综述。

关键词：一氧化氮出血性休克一氧化氮合酶

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体外分步诱导猕猴胚胎干细胞为肝细胞

Zoological Research 2009年第5期30卷 509-514页

作者：金立方纪少珲郭祥玉王喜宏季维智绍兴文理学院生命科学学院浙江绍兴312000 中国科学院昆明动物研究所云南省动物生殖生物学重点实验室云南昆明650223

采用分阶段诱导方法模拟肝细胞体内发育,建立体外诱导猕猴胚胎干细胞(rhesusmonkeyembryonicstemcells,rESCs)分化为成熟肝细胞的体系,对研究以ES细胞为基础的临床替代治疗人类晚期肝脏疾病具有重要的意义。将rESCs团块在含有10%FBS的D... 详细信息

采用分阶段诱导方法模拟肝细胞体内发育,建立体外诱导猕猴胚胎干细胞(rhesusmonkeyembryonicstemcells,rESCs)分化为成熟肝细胞的体系,对研究以ES细胞为基础的临床替代治疗人类晚期肝脏疾病具有重要的意义。将rESCs团块在含有10%FBS的DMEM培养基中悬浮培养11d,形成含有早期内胚层细胞的拟胚体(embryonicbodies,EB)并开始表达早期肝细胞的部分基因或蛋白,将11日龄EB接种至包被有ECM的组织培养皿,分阶段加入aFGF、BMP-4及OSM。经aFGF和BMP-4诱导7～10d后,分化细胞形态变为具有双核的多角形细胞,表达早期和中期肝细胞特异性的蛋白(AFP、ALB及CK18)和基因(AFP、ALB、APOH,G-6-P及TAT),并具有储存糖原的功能。撤除aFGF和BMP-4,添加OSM继续诱导7～10d,分化的细胞表达成熟肝细胞所特有基因CYP1B1和ADH1C,并具有摄取靛青绿的能力。

关键词：猕猴胚胎干细胞肝细胞细胞因子

靛玉红-3′-单肟对猕猴成纤维细胞增殖和凋亡及周期同步化的影响

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2011年第5期39卷 8-14页

作者：杨纪峰采克俊金立方高基民温州医学院生命科学学院浙江温州325035 湖州师范学院生命科学学院浙江湖州313000 绍兴文理学院生命科学学院浙江绍兴312000

【目的】研究靛玉红-3′-单肟(Indirubin-3′-monoxime)对猕猴成纤维细胞增殖、凋亡和周期同步化的影响。【方法】用PI和FITC同时对细胞进行染色,用流式细胞仪检测荧光强度,对细胞内DNA和蛋白质的含量作相对定量,分析细胞在G0,G0+G1,S,G... 详细信息

【目的】研究靛玉红-3′-单肟(Indirubin-3′-monoxime)对猕猴成纤维细胞增殖、凋亡和周期同步化的影响。【方法】用PI和FITC同时对细胞进行染色,用流式细胞仪检测荧光强度,对细胞内DNA和蛋白质的含量作相对定量,分析细胞在G0,G0+G1,S,G2+M期的分布比例;用BrdU标记法检测靛玉红-3′-单肟处理对细胞增殖的影响,用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡的发生情况。【结果】(1)与处于对数增殖期(对照)的细胞相比,10μmol/L靛玉红-3′-单肟处理30 h后,G0与G0+G1期细胞比例分别由7.27%和84.26%增加为14.21%和94.22%,差异达显著水平。(2)与对数增殖期细胞(BrdU阳性率为80%)相比,靛玉红-3′-单肟处理30 h可显著地抑制细胞的增殖,在后续标记培养24 h期间只有8.15%的细胞呈BrdU阳性,如果是在去除药物的正常条件下标记培养24 h,大多数细胞(58.28%)又可进入增殖状态。(3)与正常培养对照组细胞凋亡率(1.12%)相比,靛玉红-3′-单肟处理组凋亡发生率为1.82%,虽有所增加但差异不显著。【结论】靛玉红-3′-单肟是一种可逆的细胞周期抑制剂,对猕猴成纤维细胞增殖的抑制作用是可逆的,对细胞凋亡发生率没有显著影响。

关键词：靛玉红-3′-单肟猕猴成纤维细胞细胞增殖细胞凋亡周期同步化

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胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展

中国兽医科技 2004年第6期34卷 40-43页

作者：李吉霞王新庄金立方王轶敏河南肉牛工程技术研究中心

胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞)是由早期胚胎内细胞团(ICM)或原始生殖(PGC)细胞经体外分离、抑制分化培养获得的多潜能细胞.ES细胞具有发育分化的多潜能性和无限的自我更新能力,能在体外长期培养并具有向机体各种组织细胞分... 详细信息

胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞)是由早期胚胎内细胞团(ICM)或原始生殖(PGC)细胞经体外分离、抑制分化培养获得的多潜能细胞.ES细胞具有发育分化的多潜能性和无限的自我更新能力,能在体外长期培养并具有向机体各种组织细胞分化的潜能[1].由于ES细胞的全能性,在体外可以分化出包括3个胚层在内的所有细胞,如神经细胞、造血细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞和原始内胚层细胞等,其某些分化机理与胚胎细胞在体内的分化是一致的.因此,ES细胞可用于胚胎发育和细胞分化调控的研究,作为修复器官和器官移植的种子细胞,还可用于转基因动物的生产.

关键词：胚胎干细胞生物学特性体外诱导分化细胞因子基因

Notch signaling dependent differentiation of cholangiocyte-like cells from rhesus monkey embryonic stem cells

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Zoological Research 2011年第4期32卷 391-395页

作者：金立方纪少珲杨纪峰季维智绍兴文理学院生命科学学院浙江绍兴312000 中国科学院昆明动物研究所云南省动物生殖生物学重点实验室云南昆明650223 温州医学院生命科学学院浙江温州325035

Rhesus monkey embryonic stem（rES） cells have similar characteristics to human ES cells,and might be useful as a substitute model for preclinical *** signaling is involved in the formation of bile ducts,which are composed of ***,little is known about the role of Notch signaling in cholangiocytic commitment of ES *** analyzed the effect of Notch signaling on the induction of cholangiocyte-like cells from rES *** 80% of definitive endoderm（DE） cells were generated from rES cells after treatment with activin *** treatment with BMP4 and FGF1 on matrigel coated wells in serum-free medium,rES-derived DE gave rise to cholangiocyte-like cells by expression of cholangiocytic specific proteins（CK7,CK18,CK19,CK20,and OV-6） and genes（GSTPi,IB4,and HNF1β）.At the same time,expression of Notch 1 and Notch 2 mRNA were detected during cell differentiation,as well as their downstream target genes such as Hes 1 and Hes *** of the Notch signal pathway by L-685458 resulted in decreased expression of Notch and their downstream *** addition,the proportion of cholangiocyte-like cells declined from ～90% to ～20%.These results suggest that Notch signaling may play a critical role in cholangiocytic development from ES cells.

关键词： Rhesus monkey Embryonic stem cells Cholangiocytes Notch signaling