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作者：金宏凯锦州医科大学

学位级别：硕士

目的对猪圆环病毒3型辽宁分离株(LN-PCV3)的分子特征进行分析,并依据广泛流行的猪圆环病毒2型(PCV2)给养猪业带来的重大经济损失,特别是二者混合感染,带来更大经济损失的现状,本研究利用杆状病毒表达系统分别构建了表达PCV3 Cap基因的... 详细信息

目的对猪圆环病毒3型辽宁分离株(LN-PCV3)的分子特征进行分析,并依据广泛流行的猪圆环病毒2型(PCV2)给养猪业带来的重大经济损失,特别是二者混合感染,带来更大经济损失的现状,本研究利用杆状病毒表达系统分别构建了表达PCV3 Cap基因的单联疫苗和融合表达PCV2和PCV3 Cap蛋白基因的二联疫苗,并对其免疫原性进行评估,为PCV2和PCV3的综合防治储备了物质基础。方法参照湖北分离株HB-PCV3-2016(GenBank登录号:KY954038.1)设计特异性引物,以PCR检测PCV3阳性的样品为模板,对全基因进行PCR扩增,将PCR产物使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后,与pMD-18-T载体进行连接,转化到DH5a感受态细胞中,筛选得到的阳性克隆菌落进行质粒提取,进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的质粒送生工生物公司进行测序。将测序得到的基因序列用Mega7.0和DNAStar软件进行分析,与GenBank公布的PCV3其他分离株基因序列进行比对和分子特性分析。在此基础上,分别选取PCV2疫苗株PCV2-SH(登陆号:HM038027.1)的Cap蛋白基因和LN-PCV3的Cap蛋白基因,用刚性连接肽Linker将PCV2 Cap蛋白基因与PCV3 Cap蛋白基因进行连接融合,作为免疫原基因。根据昆虫细胞密码子偏爱性、对免疫原基因进行人工修饰、优化和合成,获得免疫原基因PCV2-3-Cap,并克隆至pMD-18-T载体,构建重组质粒T-PCV2-3-Cap。分别以优化后的PCV3-Cap蛋白基因和PCV2-3-Cap融合蛋白基因为靶基因,设计特异性引物,以T-PCV2-3-Cap为模板,扩增PCV3-Cap和PCV2-3-Cap蛋白基因,转化到DH5a感受态细胞中,筛选得到的阳性克隆菌落进行质粒提取,进行酶切鉴定。将鉴定正确的PCV3-Cap基因和PCV2-3-Cap融合基因克隆至pFastBac 1载体上,分别构建杆状病毒转移载体pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap。将pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap分别转化到DH10Bac感受态细胞中进行转座,经过蓝白斑筛选后,提取重组杆粒,并转染SF9昆虫细胞,通过筛选获得表达PCV3 Cap基因与共表达PCV2和PCV3 Cap融合基因的重组杆状病毒,经PCR,SDS-PAGE,Western blot,免疫荧光,电镜等实验方法鉴定正确后,用蔗糖密度离心法对病毒进行纯化。所得的纯化病毒作为免疫原,以1x10pfu的重组杆状病毒rvAc-PCV3-Cap与rvAc-PCV2-3-Cap免疫BALB/c小鼠,并设免疫对照组,每隔2周进行一次免疫,连续免疫三次,分别在首免后0d,14d,28d,42d对小鼠尾部进行采血并分离血清。用ELISA方法检测PCV2和PCV3的抗体水平。首免后42d,处死小鼠摘取脾脏,通过CCK-8法计算各免疫组之间小鼠的淋巴细胞增值指数SI。按照细胞因子检测试剂盒的使用方法,对免疫小鼠的IL-2,IL-4,IFN-γ等细胞因子进行检测,从而验证PCV3-Cap蛋白基因、PCV2-3-Cap融合蛋白基因在杆状病毒系统中的表达效果及其免疫原性。结果通过PCR方法从PCV3阳性样品中,克隆到PCV3全基因序列,长度为2000bp,命名为LN-PCV3(GenBank登录号:MH177453.1)。遗传进化树分析显示,我国目前流行的PCV3分离株可形成3个分支(3a簇、3b簇与3c簇),LN-PCV3株处于3a簇分支中,与湖北株HB-PCV3-2016(GenBank登录号:KY354039.1)同源性最高,达到99.7%。在此基础上,将构建的重组杆状病毒转移载体pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap,分别转化到DH10Bac感受态细胞中进行转座后,PCR交叉检验证明获得重组杆粒rAcBacmid-PCV3-Cap和rAcBacmid-PCV2-3-Cap。然后将重组杆粒转染SF9昆虫细胞,制备重组杆状病毒,重组杆状病毒连续传代3次,传代3次(P3代)重组杆状病毒rvAc-PCV3-Cap与rvAc-PCV2-3-Cap经透射电镜观察,可见假病毒粒子和杆状病毒粒子。用M13通用引物、PCV3-Cap基因特异引物、PCV2-3-Cap基因特异性引物分别进行PCR扩增,可见674bp与2974bp,1514bp与3814bp处出现目的片段,大小均与理论值一致。分别通过SDS-PAGE和Western blot检测,在30kD与55kD处出现目的条带。通过免疫荧光实验,两组重组蛋白在荧光显微镜下均出现绿色荧光,正常细胞未出现荧光效果,证明PCV3-Cap基因、PCV2-3-Cap融合基因在SF9细胞中获得表达,并且成功筛选到重组杆状病毒rvAc-PCV3

关键词：猪圆环病毒3型(PCV3) 分子特性分析 Cap蛋白二联苗免疫原性分析

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PCV-2和PCV-3 Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和鉴定

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中国兽医杂志 2023年第6期59卷 55-59页

作者：董宇璠金宏凯孙莉费东亮马跃宇马鸣潇李明锦州医科大学畜牧兽医学院辽宁锦州121000 锦州医科大学生命科学研究院辽宁锦州121000 锦州医科大学实验动物中心辽宁锦州121000

为了实现猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,本试验利用刚性连接肽连接PCV-2和PCV-3 Cap基因,构建杆状病毒转移载体pFastBac-PCV-2-3-Cap,双酶切验证正确后,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,... 详细信息

为了实现猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,本试验利用刚性连接肽连接PCV-2和PCV-3 Cap基因,构建杆状病毒转移载体pFastBac-PCV-2-3-Cap,双酶切验证正确后,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组杆粒。将重组杆粒转染SF9细胞(昆虫卵巢细胞),盲传3代,获得重组病毒。将重组病毒接种SF9细胞96 h后,通过细胞免疫荧光检测、Western blot和电镜观察对其进行验证,并利用噬斑法检测其效价。结果显示:成功构建重组质粒pFastBac-PCV-2-3-Cap,获得了重组杆粒rAcBacmid-PCV-2-3-Cap,并制备出重组杆状病毒rvAc-PCV-2-3-Cap。重组病毒感染SF9细胞后,目的蛋白成功表达,并可以形成病毒样颗粒,病毒效价为3.41×10^(6) PFU/mL。本试验成功在昆虫细胞-杆状病毒系统中共表达了PCV-2-3-Cap,为防治PCV-2和PCV-3混合感染的二联疫苗研究提供了数据支持。

关键词： PCV-2 PCV-3 重组质粒杆状病毒真核表达

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中华蜜蜂囊状幼虫病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

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病毒学报 2017年第6期33卷 914-919页

作者：张鹤李明孙莉费东亮岳金金金宏凯马鸣潇锦州医科大学畜牧兽医学院锦州121000

为了制备中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)单克隆抗体,本实验利用纯化的中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)免疫Balb/c小鼠,经过3次免疫后,小鼠断尾采血测其血清效价,选择效价高于1∶80 000的小鼠,在细胞融合前3~4d再加强免疫一次。取免疫小鼠脾... 详细信息

为了制备中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)单克隆抗体,本实验利用纯化的中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)免疫Balb/c小鼠,经过3次免疫后,小鼠断尾采血测其血清效价,选择效价高于1∶80 000的小鼠,在细胞融合前3~4d再加强免疫一次。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后注射入Balb/c小鼠(Mus musculus)腹腔制备单抗腹水。共获得9株稳定分泌抗CSBV的单克隆抗体,命名为10A1、5B10、5A5、5H2、11D7、9A5、1D3、3C10、10C4,效价都在1∶16 000以上,经间接ELISA实验检测表明,具有较好的特异性。在此基础上,将9株腹水单抗分别与CSBV互作后,接种于2~3日龄中华蜜蜂幼虫,观察幼虫死亡率,研究单克隆抗体中和CSBV病毒能力,结果表明筛选到三株单克隆抗体(10A1、5A5、9A5)对CSBV有中和作用,为CSBV的防治研究奠定了基础。

关键词：中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV) 杂交瘤细胞单克隆抗体(McAb)

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RNAi靶向VP2基因抑制中蜂囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内复制研究

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病毒学报 2019年第1期35卷 96-102页

作者：马跃宇费东亮郭亚茜金宏凯张溪研马鸣潇锦州医科大学生命科学研究院锦州121000

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,R... 详细信息

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用和其对CSBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响,设计合成针对CSBV VP2基因的特异性siRNA,以100 nM的浓度与pEGFPN1-VP2-CSBV融合表达载体共同转染至293T细胞中,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析siRNA在体外对CSBV VP2基因表达的干扰效果。同时,将siRNA(1μg/μL)和1×10~7拷贝数的CSBV共同饲喂2日龄中华蜜蜂幼虫,检测幼虫体内CSBV拷贝数和幼虫存活率,研究siR-NA对中华蜜蜂幼虫体内CSBV复制的影响。荧光结果显示,在293T细胞中siRNA能抑制CSBV VP2蛋白的表达,并且通过流式细胞仪检测分析发现干扰效果接近40%。幼虫饲喂实验表明,饲喂siRNA组在各时间点幼虫体内CSBV拷贝数均低于CSBV对照组,且在摄入siRNA后感染CSBV的幼虫存活率明显上升,与CSBV组差异极显著(P<0.01)。通过本研究,证明了针对CSBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi,影响CSBV在中蜂体内的复制,为深入研究CSBV VP2基因的功能和研发抗CSBV生物制剂提供了理论基础。

关键词：中蜂囊状幼虫病毒(CSBV) 结构蛋白基因VP2 RNA干扰病毒复制

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猪圆环病毒3型全基因克隆及遗传演化分析

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畜牧与兽医 2019年第2期51卷 70-75页

作者：金宏凯马宇驰孙莉樊琼董媛媛马鸣潇锦州医科大学畜牧兽医学院辽宁锦州121000

辽宁地区某猪场发现疑似断奶仔猪多系统综合征(PMWS),经临床症状、病理变化和PCR检测,确诊为猪圆环病毒3型(PCV3)感染;根据Gen Bank中收录的PCV3基因序列,设计2对特异性引物,从患有PMWS的仔猪内脏组织中扩增PCV3全基因序列,克隆到p MD1... 详细信息

辽宁地区某猪场发现疑似断奶仔猪多系统综合征(PMWS),经临床症状、病理变化和PCR检测,确诊为猪圆环病毒3型(PCV3)感染;根据Gen Bank中收录的PCV3基因序列,设计2对特异性引物,从患有PMWS的仔猪内脏组织中扩增PCV3全基因序列,克隆到p MD18-T载体中,经测序、拼接获得PCV3全长c DNA序列,利用DNAStar和DNAman生物软件对全基因组进行遗传变异分析。结果显示:PCV3毒株基因组全长2 000 bp,命名为CN/Liaoning-2017 (简称LN株)(GenBank登录号:MH177453. 1),基因组有3个开放阅读框(ORF),其中2个ORF编码的蛋白与圆环病毒的复制相关蛋白(Rep)和衣壳蛋白(Cap)同源。Cap基因大小为645 bp,编码214个氨基酸。PCV3国内株可分为3大分支(3a簇、3b簇与3c簇),LN株处于3a簇分支中,与湖北株(KY354039. 1)同源性最高,达到99. 7%; LN株与PCV3a簇代表株(PCV3-USMN2016,PCV3-US-MO2015)同源性在98. 8%～99. 2%之间,与PCV3b簇代表株(PCV3-US-SD2016)的同源性为98. 8%,与PCV3c簇代表株(PCV3-China-GD-2016)同源性为98. 7%。Cap蛋白氨基酸位点分析显示,LN株在第68位发生突变,与其他代表株都不相同。以上试验结果表明,成功从患有PMWS的仔猪体内克隆了PCV3全基因,并完成了序列分析。LN株是辽宁省首次发现的PCV3毒株,这些数据将为研究PCV3的遗传变异和流行病学特征提供分子生物学依据。

关键词：猪圆环病毒3型全基因组克隆遗传演化

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乙肝相关性肝癌组织中mTOR、HBx蛋白的表达及意义

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锦州医科大学学报 2021年第2期42卷 35-39页

作者：金宏凯刘星高峰蔺广荣锦州医科大学锦州医科大学附属第一医院辽宁锦州121000 滨州市人民医院普外科山东滨州256610

目的探讨雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、乙肝病毒基因X开放读框编码的乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X pratein,HBx)在乙肝相关性肝癌组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学(strept avidin-biotion c... 详细信息

目的探讨雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、乙肝病毒基因X开放读框编码的乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X pratein,HBx)在乙肝相关性肝癌组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学(strept avidin-biotion complex,SABC)法检测69例乙肝相关性肝癌和相应癌旁组织中mTOR、HBx蛋白的表达,并探讨其与乙肝相关性肝癌临床病理特征及预后的关系。结果免疫组化结果显示:mTOR、HBx蛋白在癌组织(57.97%,66.67%)的表达均高于癌旁组织(11.59%,17.39%),差异有统计学意义(χ^(2)分别为32.711、34.381,P0.05)。经Spearman分析,两者表达呈正相关(r=0.644,P=0.000)。随访结果显示:mTOR、HBx蛋白高表达组中位生存时间为13个月,95%置信区间为10.754~15.246,低表达组中位生存时间为27个月,95%置信区间为22.671~31.329,经Log-rank检验分析比较差异有统计学意义(P=0.031)。结论mTOR、HBx蛋白相互作用可能共同参与了乙肝相关性肝癌的发生与发展,且与患者预后有关。

关键词： mTOR HBx 乙肝相关性肝癌免疫组织化学预后

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草原沙化治理围栏技术探讨

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现代畜牧兽医 2010年第2期 55-56页

作者：刘文辉金宏凯陈俊娥董文霞辽宁省凌源市四合当镇动物卫生监督所辽宁凌源122508

草原沙化治理的关键在于围栏，只有围栏围得好、护得严，保证牲畜不进入，才能保证草原生态的恢复和植被的绿化，保持生态的平衡，真正达到沙化治理的目的。结合围栏实际，笔者对草原围栏过程中的几个环节总结如下，供大家参考。

关键词：草原围栏草原生态沙化治理技术牲畜

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中蜂囊状幼虫病毒基因分型及其代表毒株生物学特性比较

中蜂囊状幼虫病毒基因分型及其代表毒株生物学特性比较

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会...

作者：费东亮胡影岳金金张鹤魏东郭亚茜马跃宇金宏凯李明孙莉马鸣潇锦州医科大学

引言蜜蜂囊状幼虫病(Sacbrood disease,SBD)是一种由蜜蜂囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)引起的分布广,传播快的蜜蜂病毒病。该病主要感染2日龄的小幼虫并导致其死亡,感染成年蜜蜂可缩短其寿命,但不出现疾病症状。SBV于1972年在我国...

引言蜜蜂囊状幼虫病(Sacbrood disease,SBD)是一种由蜜蜂囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)引起的分布广,传播快的蜜蜂病毒病。该病主要感染2日龄的小幼虫并导致其死亡,感染成年蜜蜂可缩短其寿命,但不出现疾病症状。SBV于1972年在我国广东省首次发现感染东方蜜蜂,并命名为中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV),随后迅速蔓延至我国的大部分地区,不但

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长三角地区人口空间均衡模型建构及应用

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地理学报 2024年第2期79卷 390-401页

作者：程晨丁金宏顾高翔田阳上海立信会计金融学院财税与公共管理学院上海201209 华东师范大学人口研究所上海200241

人口均衡是中国人口发展的重要战略目标,人口空间均衡是人口均衡的空间表现,其对区域均衡发展也有着重大意义。本文在个体迁移行为的基础上提出了一个新的多区域人口空间均衡概念,并利用工资率、区域条件指数、城市拥挤程度及地理距离... 详细信息

人口均衡是中国人口发展的重要战略目标,人口空间均衡是人口均衡的空间表现,其对区域均衡发展也有着重大意义。本文在个体迁移行为的基础上提出了一个新的多区域人口空间均衡概念,并利用工资率、区域条件指数、城市拥挤程度及地理距离等指标,构建了一个基于个体迁移行为的多区域人口—经济—资源环境均衡模型(RESPE),并以长江三角洲地区为例,分析了现有条件下均衡人口空间分布状态。研究发现:均衡状态下长三角地区人口呈现沿江、沿海集聚,主要包括苏南沿江、杭州湾沿海及南京至苏北的运河沿线,以上海为核心的人口空间高集中度圈层结构依然明显;沪宁杭等引力区具有强劲的人口集聚潜力;斥力区多紧邻准均衡区,且广泛分布于江苏北部及浙江、安徽的多数区域。在自由迁移条件下,长三角地区人口将进一步向沪宁杭及苏南地区集聚。

关键词：人口空间均衡空间结构劳动力迁移推拉理论长三角地区

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论生育价值的建构、解构与再建构

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社会科学 2024年第7期 144-153页

作者：丁金宏赵启行华东师范大学人口研究所

生育行为是人们对当下生育价值判断的结果，生育价值的膨胀与收缩内生性地影响生育率的上升和下降。生育价值可以分为情感、安全、财富和礼俗等四种要素，传统社会这些价值处于高位，奠定了稳定高生育率的价值基础。工业革命以来的现代... 详细信息

生育行为是人们对当下生育价值判断的结果，生育价值的膨胀与收缩内生性地影响生育率的上升和下降。生育价值可以分为情感、安全、财富和礼俗等四种要素，传统社会这些价值处于高位，奠定了稳定高生育率的价值基础。工业革命以来的现代化进程，以横向和纵向两种方式不断解构生育价值，使生育率层层跌破替代生育率、陷阱生育率等临界点，以致新世纪以来人口负增长由点到面扩展、由浅入深加剧，酝酿人口发展的种种现实和潜在危机。新时期中国生育价值的再建构是保护和提升生育力的必要手段，可以从情感价值重点突破，倡导“为爱而生，以生养爱”的婚育价值观，辅以礼俗、财富和安全价值引导，庶几可以逐步挽回生育率颓势，实现长期生育率向替代水平复归。

关键词：生育价值边际生育率解构再建构人口转变

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