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小鼠催产素受体基因编码区全长的克隆和真核表达

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细胞与分子免疫学杂志 2004年第4期20卷 491-494页

作者：金亮金卫林鞠躬第四军医大学神经科学研究所陕西西安710032

目的 :为了获得小鼠催产素受体 (mouseoxytocinreceptor,mOTR)基因的全长编码区和构建mOTR的真核表达载体 ,以及在哺乳动物细胞中真核表达mOTR。方法 :采用RT PCR方法 ,获得有相互重叠序列的mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段并分别将其... 详细信息

目的 :为了获得小鼠催产素受体 (mouseoxytocinreceptor,mOTR)基因的全长编码区和构建mOTR的真核表达载体 ,以及在哺乳动物细胞中真核表达mOTR。方法 :采用RT PCR方法 ,获得有相互重叠序列的mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段并分别将其亚克隆入PMD 18 T载体。通过对这 2个片段加入酶切位点、双酶切和相互连接 ,获得全长的编码序列。然后将mOTR的全长的编码序列克隆入真核表达载体pEGFP N3,再用脂质体转染法将pEGFP N3 mOTR质粒转染到COS 7细胞中并进行了瞬时真核表达。结果 :将mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段亚克隆入了PMD 18 T载体。连接并最终获得了mOTR编码区的全长序列 ,构建了pEGFP N3 mOTR真核表达载体。将pEGFP N3 mOTR载体转染入COS 7细胞 ,并成功地进行了瞬时真核表达。结论 :成功构建了包含mOTR全长编码区序列的pEGFP N3 mOTR真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行了瞬时表达 ,为今后研究mOTR的功能打下了基础。

关键词：催产素受体 RT—PCR 克隆真核表达

脉络丛和大脑皮层的细胞功能紊乱诱发新冠病毒导致的神经症状

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Science Bulletin 2021年第24期66卷 2442-2444页

作者：毛小元金卫林 Department of Clinical Pharmacology Xiangya HospitalCentral South UniversityChangsha 410008China Institute of Clinical Pharmacology Central South UniversityHunan Key Laboratory of PharmacogeneticsChangsha 410078China Engineering Research Center of Applied Technology of Pharmacogenomics Ministry of EducationChangsha 410078China National Clinical Research Center for Geriatric Disorders Changsha 410008China Institute of Cancer Neuroscience Medical Frontier Innovation Research CenterThe First Hospital of Lanzhou UniversityThe First Clinical Medical College of Lanzhou UniversityLanzhou 730000China

Patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19) often succumb to neurological manifestations such as loss of smell, headache, disturbed consciousness, seizure, and stroke. In a recent paper published in Nature, Yang et al.[1] reported substantial cellular perturbations in the choroid plexus and cortex, notably an infiltration of peripheral T cells into the parenchyma and microglial activation and astrogliosis with distinct transcriptional profiles. These findings provide a complex view of the cellular and molecular processes underlying COVID-19-related neurological abnormalities.

关键词：神经症状 al. cortex

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大鼠Notch1胞质段的克隆及其表达

生物化学与生物物理进展 2001年第3期28卷 362-366页

作者：金卫林廖柏松鞠躬第四军医大学神经科学研究所西安710032

Notch 1信号途径参与决定细胞命运 ,其水解后产生的活性片段———胞质段 (Notch 1intracellularcytoplasmicdomain ,NICD)能被转运进核 ,激活下游靶基因的表达 .Notch 1参与细胞的增殖、分化、程序性死亡、发育过程中的形态发生和器官... 详细信息

Notch 1信号途径参与决定细胞命运 ,其水解后产生的活性片段———胞质段 (Notch 1intracellularcytoplasmicdomain ,NICD)能被转运进核 ,激活下游靶基因的表达 .Notch 1参与细胞的增殖、分化、程序性死亡、发育过程中的形态发生和器官形成等许多重要过程 .为了获得重组的NICD ,以大鼠脑cDNA文库为模板 ,用PCR方法扩增出编码NICD的基因片段 ,克隆至谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX KG中 ,并在大肠杆菌中获得较高水平的表达 .表达的融合蛋白GST NICD分子质量约为 12 0ku左右 ,以包涵体和可溶性两种形式存在 ,易于亲合层析纯化 .为制备抗体和进一步的功能研究奠定了基础 .

关键词： Notch1 胞质段克隆表达神经元重组蛋白

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靶向srGAP家族的串联短发夹RNA表达

上海交通大学学报 2012年第5期46卷 803-807页

作者：马跃戴云凯陈铿米亚静金卫林上海交通大学生命科学与技术学院上海200240

为了解析不同srGAP蛋白在神经元发育中的补偿效应,构建了一种同时靶向srGAP家族成员srGAP1～3的串联短发夹RNA表达系统.通过设计,合成多个寡核苷酸,利用微小RNA表达载体构建相应srGAP基因的短发夹RNA表达质粒,并利用蛋白免疫印迹法筛选... 详细信息

为了解析不同srGAP蛋白在神经元发育中的补偿效应,构建了一种同时靶向srGAP家族成员srGAP1～3的串联短发夹RNA表达系统.通过设计,合成多个寡核苷酸,利用微小RNA表达载体构建相应srGAP基因的短发夹RNA表达质粒,并利用蛋白免疫印迹法筛选敲减作用明显的靶向不同srGAP基因的短发夹RNA,然后,将其串联到同一载体而构建成可以同时靶向srGAP家族的短发夹RNA串联重组质粒.结果表明,筛选得到了分别针对srGAP1～3的短发夹RNA J17、J24和J33,并构建出能够同时靶向srGAP1～3基因的串联短发夹RNA J1+2+3.

关键词： srGAP酶激活蛋白短发夹核糖核酸核糖核酸干扰蛋白免疫印迹

人Nanog基因的克隆及其在COS-7L细胞中的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2004年第4期20卷 495-498页

作者：柳霞龙梅蒋晖金卫林焦西英鞠躬第四军医大学神经科学研究所陕西西安710032

目的 :克隆人Nanog基因 ,构建其真核表达载体 ,并观察其在哺乳动物细胞COS 7L中的表达。方法 :利用HE2 93细胞的人基因组DNA为模板 ,以LA PCR技术 ,扩增Nango的基因 ,定向克隆到带Flag标签的pCMV载体中 ,测序后 ,挑选序列正确的真核表... 详细信息

目的 :克隆人Nanog基因 ,构建其真核表达载体 ,并观察其在哺乳动物细胞COS 7L中的表达。方法 :利用HE2 93细胞的人基因组DNA为模板 ,以LA PCR技术 ,扩增Nango的基因 ,定向克隆到带Flag标签的pCMV载体中 ,测序后 ,挑选序列正确的真核表达质粒pFlag Nanog转染COS 7L细胞。用抗Flag标签的抗体 ,进行Westernblot和间接免疫荧光染色法检测Nango蛋白的表达。结果 :从人基因组DNA中克隆到序列正确的Nanog全长编码序列。所构建的Nanog质粒在COS 7L细胞中获得高效表达。结论 :人Nanog基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS 7L中的表达均获得成功 ,为进一步研究其功能 ,尤其是探讨其在神经干细胞中的作用奠定了基础。

关键词：人 Nanog 克隆分子真核表达

细胞毒力因子CagA上调人胃黏膜上皮GES-1细胞TET2蛋白的表达

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中国肿瘤生物治疗杂志 2013年第2期20卷 153-158页

作者：张昕付华林郅晓金卫林崔大祥上海交通大学微纳科学技术研究院生物纳米工程研究室微纳制造技术国家重点实验室薄膜与微细技术教育部重点实验室上海200240

目的:探讨幽门螺旋杆菌细胞毒素相关基因A(cytotoxin associated gene A,CagA)与胃黏膜中TET2(ten-eleventranslocation 2)蛋白表达的关系,以及TET2在CagA致癌过程中可能的作用。方法:Real-time PCR检测人胃黏膜上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株MGC-803中TET2 mRNA的表达水平,细胞免疫染色法检测TET2蛋白的细胞定位及表达。将pEGFP-CagA通过脂质体介导转染GES-1细胞,用200μmol/L H2O2处理GES-1细胞建立氧化应激模型,流式细胞仪检测细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)和细胞周期的变化。结果:TET2 mRNA在GES-1细胞的表达水平低于胃癌MGC-803细胞(1.00±0.08 vs 1.68±0.07,P<0.05),TET2蛋白在GES-1细胞表达水平低于胃癌MGC-803细胞(8.09±3.57 vs14.60±2.31,P<0.05)。与阴性对照组pEGFP-N1相比,pEGFP-CagA转染组GES-1细胞中TET2 mRNA表达水平升高(1.00±0.04 vs 0.06±0.00,P<0.05),TET2蛋白表达水平也升高(16.45±4.40 vs 10.82±3.39,P<0.05),ROS积累水平升高(18.39±4.52 vs 15.31±4.40,P<0.05),细胞周期检测出现明显的凋亡峰。氧化应激(H2O2处理)模型中GES-1细胞与空白对照GES-1细胞相比,TET2 mRNA水平升高(1.44±0.02 vs 1.00±0.04,P<0.05),TET2蛋白表达水平增高(15.72±4.52vs 11.74±4.34,P<0.05)。结论:幽门螺旋杆菌毒力因子CagA可诱导GES-1细胞ROS增高和细胞周期的失衡,氧化应激可以诱导TET2表达上调,TET2可能参与CagA的致癌过程。

关键词：细胞毒素相关基因A(CagA) 幽门螺旋杆菌 TET2蛋白胃癌 MGC-803细胞株 GES-1细胞株活性氧

逆转录病毒介导的人NT-3在嗅神经鞘细胞中的表达及活性检测

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实验生物学报 2003年第1期36卷 5-12页

作者：杨浩金卫林王春婷游思维鞠躬第四军医大学神经科学研究所西安710032

本文构建了pRev-TRF-NT-3的逆转录病毒表达载体,通过Fcopack293细胞将其与pRev-Tet-On分别进行包装,制备了重组缺陷型的hNT-3和Tet-on逆转录病毒,用这两种病毒感染原代培养大鼠嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs),并经强... 详细信息

本文构建了pRev-TRF-NT-3的逆转录病毒表达载体,通过Fcopack293细胞将其与pRev-Tet-On分别进行包装,制备了重组缺陷型的hNT-3和Tet-on逆转录病毒,用这两种病毒感染原代培养大鼠嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs),并经强力霉素(Dox)诱导,获得Dox浓度依赖性hNT-3表达的OECs,最后经过Western-Blot检测hNT-3的表达以及通过DRG与NT-3转染后OECs联合培养来对表达的hNT-3活性进行鉴定,结果:(1)hNT-3-pcDNA的多克隆位点,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,PCR扩增,再用Sall和Hind Ⅲ切下全长编码的hNT-3 cDNA,定向连接到pRev-TRF上,pRev-TRF全长为6.5kb,NT-3全长为0.78kb,pRev-TRE-NT-3重组体经过鉴定,确认插入子的方向和完整性,结果与预期相符。(2)hNT-3修饰的OECs培养上清经Western-blot检测,与hNT-3抗体结合的蛋白条带分子量约为28kd,hNT-3修饰过的OECs上清表达量明显高于未转染组OECs的表达量,且hNT-3表达量与Dox浓度有依赖性。(3)与hNT-3修饰的OECs联合培养背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),有许多DRG细胞向外迁移,这些细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络。而未修饰的OECs组,只有少量的细胞迁移生长,细胞迁移和突起生长都很局限,空白对照组的DRG没有向外迁移的细胞和向外延伸的突起;且对照组的突起生长长度明显比NT-3修饰的实验组短(P<0.01)。这些结果表明,Tet-On调控NT-3表达在OECs转染成功,为进一步体内移植修复损伤提供了理想的材料。

关键词：逆转录病毒介导人NT-3 嗅神经鞘细胞表达活性检测神经营养素-3 载体细胞培养背根神经节基因治疗

Proline rich结构域介导Nogo-A激活NF-κB信号

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生物化学与生物物理进展 2009年第3期36卷 371-377页

作者：戴金祥陈铿金卫林鞠躬上海交通大学生命科学技术学院神经科学研究所上海200240

髓鞘来源的中枢神经再生抑制因子——Nogo-A被发现除表达于成熟的少突胶质细胞,还广泛高表达于多种类型的神经元中.目前,神经元中Nogo-A的功能还不明确.为探讨神经元内Nogo-A的功能,以HEK293FT细胞为模型,利用信号途径报告基因系统筛选... 详细信息

髓鞘来源的中枢神经再生抑制因子——Nogo-A被发现除表达于成熟的少突胶质细胞,还广泛高表达于多种类型的神经元中.目前,神经元中Nogo-A的功能还不明确.为探讨神经元内Nogo-A的功能,以HEK293FT细胞为模型,利用信号途径报告基因系统筛选过表达Nogo-A对多种信号途径的调控作用,发现过表达Nogo-A能特异激活NF-κB信号,利用不同的Nogo-A剪接体和截断体形式研究,证明Nogo-A激活NF-κB信号依赖于其氨基端的prolinerich结构域,进一步使用NF-κB信号途径相关分子显性突变体揭示IκBα、TRAF6、Rac/Cdc42参与Nogo-A激活NF-κB信号.结果提示,Nogo-A可以显著激活NF-κB信号,且依赖于Nogo-A氨基段的prolinerich结构域.

关键词： Nogo-A,NF-κB,proline rich结构域,HEK293FT细胞

大鼠中枢神经系统中Nogo-A分子的表达研究

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大鼠中枢神经系统中Nogo-A分子的表达研究

作者：金卫林第四军医大学

学位级别：硕士

过去的一年，中枢神经再生研究中一个主要的进展就是Nogo基因的克隆。髓鞘表达的Nogo蛋白可能是CNS轴突再生失败的主要因素。目前，对于Nogo分子的认识主要来源于针对NI-250（Nogo-A）的单克隆抗体IN- 1。体内应用IN-1可以诱导损伤的... 详细信息

过去的一年，中枢神经再生研究中一个主要的进展就是Nogo基因的克隆。髓鞘表达的Nogo蛋白可能是CNS轴突再生失败的主要因素。目前，对于Nogo分子的认识主要来源于针对NI-250（Nogo-A）的单克隆抗体IN- 1。体内应用IN-1可以诱导损伤的纤维长距离地延伸，并可引起某些特定的反射、运动功能的恢复。Nogo分子有三种不同的剪接体—Nogo-A，-B，-C，它们都具有相同的188个氨基酸的C-末端，与Reticulon家族成员高度同源。在Nogo分子的C-末端，有两个跨膜片段，被66个氨基酸残基组成的环状结构（Nogo-66）所分隔。在体外培养系统中，Nogo-A分子的酸性氨基端和Nogo-66片断都表现出强的抑制突起生长的活性，提示该分子可能具有两个不同的抑制性结构域。新近克隆的带有LRR结构域GPI蛋白—NgR可能作为受体介导Nogo-66的抑制轴突生长的作用。 Northern Blot和原位杂交结果证明，Nogo-A mRNA不仅在CNS的寡突胶质细胞中表达，还表达于成年和发育阶段的脑、脊髓和外周神经节的某些神经元中。以往，所有IN-1的研究都没有提供NI-250（Nogo-A）在神经元表达的证据，而且IN-1抗体识别抗原的特异性一直是个疑问。那么，IN- 1中和的抑制活性与Nogo-A分子表现出的抑制功能之间是否相对应？换句话说，可被IN-1识别的多种抗原分子所显示的抑制效应是否完全与Nogo-A 分子相关？为此，本研究首先从蛋白质水平，对成年和发育阶段的Nogo-A 分子的表达情况进行了初步的研究，具体过程和结果如下：第四军医大学硕士研究生论文一 1）利用高保真性 PCR反应系统，从人胎脑 CDNA文库中扩增到编码人的全长NOgO－A，－B，（和NgR的基因，从成年大鼠脑CDNA文库中扩增到大鼠的 NgR基因，所有的 PCR产物克隆到 T七asy载体，测序证实。利 ’用DNA重组技术构建了一系列的原核和真核表达载体。获得的缺失 prolinehch区段的短Nogo－A分子－gogo－T和大鼠的NgR基因，己被Genbank 收录（登录号：AF320999，AY028438）。 2）用原核表达、纯化后的GST－NOgO融合蛋白，免疫制备兔多克隆抗体。Weste。blot分析鉴定抗体特异识别人和大鼠的 Nogo－A分子。体外培养的寡突胶质细胞与anti－Nogo抗体有特异的阳性反应。 3）免疫荧光染色提示NOgO－A分子在CNS有广泛的分布和复杂的细胞、亚细胞定位。除寡突胶质细胞外，神经元和某些anti－GFAP标记的胶质细胞表达Nogo－A分子。在神经元中，可以观察到胞膜、胞浆的细胞器和细胞核内有ntiNOgO反应阳性样物质。 4）RTPCR、Western blot分析揭示 Nogo－A分子在胚胎期就有高水平的表达，而且在所有检查的发育阶段没有明显的变化。在NOgO叭分子表达的时间模式上，与髓鞘的发育、分化和形成关系并不象以前IN－l提示的结果。进行亚细胞分级分离 Western blot分析，观察到在脊髓和小脑不同发育阶段，亚细胞组分中NOgO－A分子有明显的不同。 5）体外基因转染COS细胞观察到NOgO－A分子可以到达细胞核，与大鼠NOtChl ICD共转染进一步证实EGFPNOgO－A主要分布在细胞核。以上研究结果表明，胚胎、发育和成年的CNS中有广泛的NOgo－A分子的表达。胚胎的 14天，CNS就有高水平的 Nogo－A的 InRNA分子表达，而在所有检查的时间点，没有观察到明显的表达变化。NOgO－A分子在开始表达的时间上与IN－1敏感的抑制活性（大鼠的脊髓PZ开始出现）并不一致，提示Nogo－A分子与髓鞘的成熟化进程关系可能并不很密切。Nogo－A分子在神经元中表达和细胞核中存在NOgO－A分子这两个现象提示NOgO－A分子功能的复杂性。

关键词：大鼠, Nogo-A, RT-PCR, Western blot, IN-1, 中枢再生, 克隆, 发育, 基因转染, 神经元, 寡突胶质细胞, 髓鞘, 轴突生长抑制因子