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链霉菌胞外多糖139A生物合成中引导糖基转移酶基因的克隆和鉴定

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Acta Genetica Sinica 2003年第8期30卷 723-729页

作者：王玲燕李师弢郭连宏姜蓉李元中国医学科学院医药生物技术研究所北京100050

链霉菌 139能够产生一种新的胞外多糖 139A ,该多糖具有抗类风湿性关节炎的活性。为研究多糖 139A的生物合成基因簇 ,首要策略是克隆到在多糖 139A的生物合成中起关键作用的引导糖基转移酶基因。根据其他几个种属的糖基转移酶氨基酸序... 详细信息

链霉菌 139能够产生一种新的胞外多糖 139A ,该多糖具有抗类风湿性关节炎的活性。为研究多糖 139A的生物合成基因簇 ,首要策略是克隆到在多糖 139A的生物合成中起关键作用的引导糖基转移酶基因。根据其他几个种属的糖基转移酶氨基酸序列的两个保守区域设计简并引物 ,通过PCR方法扩增出相应的DNA片段作为探针 ,从链霉菌 139基因组文库中分离到引导糖基转移酶基因ste5 ,并定位于约 32kb的基因簇上。序列分析发现其蛋白序列与引导糖基转移酶具有较高的同源性 ,其C 端含有A ,B和C 3个保守区 ,N 端具有 5个跨膜区。引导糖基转移酶基因阻断突变株不能够产生多糖 139A表明其参与多糖 139A的生物合成。

关键词：微生物胞外多糖生物合成糖基转移酶基因阻断链霉菌

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葡激酶在变铅青链霉菌中的克隆和分泌表达

中国医学科学院学报 1998年第6期20卷 428-432页

作者：程泳李元刘伯英郭连宏中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所北京100050

目的　构建可分泌表达葡激酶的基因工程链霉菌。方法　通过 PCR方法扩增得到包括葡激酶结构基因和分泌信号肽基因在内的 730 bp的 DNA片段 ,将该片段插入变铅青链霉菌质粒 p IJ45 9的 erm强启动子下游 ,构建重组质粒p IJ45 9SAK,转化... 详细信息

目的　构建可分泌表达葡激酶的基因工程链霉菌。方法　通过 PCR方法扩增得到包括葡激酶结构基因和分泌信号肽基因在内的 730 bp的 DNA片段 ,将该片段插入变铅青链霉菌质粒 p IJ45 9的 erm强启动子下游 ,构建重组质粒p IJ45 9SAK,转化变铅青链霉菌 TK5 4。结果　获得含有该重组质粒的基因工程菌株 ,经发酵培养基培养 72 h后 ,发酵液离心取上清用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 ,可见相对分子量约为 1 6 0 0 0的特异性蛋白条带 ;用溶纤平皿法可测得溶纤活性。结论　葡激酶已在所构建的基因工程菌中分泌表达且具有溶纤活性。

关键词：葡激酶链霉菌克隆表达基因工程

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真菌来源新活性化合物2460A的研究

药学学报 2011年第2期46卷 165-169页

作者：齐小强朱凤昌张洋郭连宏姜蓉何琪杨李元中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

采用自行构建的以重组白细胞介素6受体(IL-6R)为靶位,基于受体配基竞争结合为基础的高通量筛选模型,从微生物代谢产物中获得了新结构化合物2460A。本文通过对产生菌核糖体DNA转录间隔区(rDNA-ITS)序列测定结果,确定了该化合物产生菌为... 详细信息

采用自行构建的以重组白细胞介素6受体(IL-6R)为靶位,基于受体配基竞争结合为基础的高通量筛选模型,从微生物代谢产物中获得了新结构化合物2460A。本文通过对产生菌核糖体DNA转录间隔区(rDNA-ITS)序列测定结果,确定了该化合物产生菌为哈茨木霉;研究结果显示,2460A具有和白细胞介素6(IL-6)竞争结合白细胞介素6受体(IL-6R)的活性,因此是具有IL-6R配基活性的微生物产物;MTT法测定结果表明,2460A对CM126和HT-29肿瘤细胞具有抑制作用,IC50分别为2.17×10-5 mol·L-1和1.8×10-5 mol·L-1;对肿瘤细胞周期影响作用实验结果显示,2460A对HT-29细胞的S期略有阻滞作用。本化合物体内抗瘤活性等深入研究工作正在进行中。

关键词： 2460A 哈茨木霉 IL-6R配基抗肿瘤活性细胞周期

链霉菌I06A-02832产生的VEGFR2-CD拮抗剂发现研究

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中国抗生素杂志 2014年第6期39卷 408-412,421页

作者：蒋忠科张洋郭连宏姜蓉孙承航中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050

目的分离鉴定链霉菌I06A-02832发酵液中具血管内皮细胞生长因子受体-2酪氨酸激酶(VEGFR2-CD)抑制活性的次生代谢产物。方法采用大孔吸附树脂、Se phadex LH-20、HPLC等分离手段对次生代谢产物进行分离纯化;通过质谱(MS)、核磁共振波谱(N... 详细信息

目的分离鉴定链霉菌I06A-02832发酵液中具血管内皮细胞生长因子受体-2酪氨酸激酶(VEGFR2-CD)抑制活性的次生代谢产物。方法采用大孔吸附树脂、Se phadex LH-20、HPLC等分离手段对次生代谢产物进行分离纯化;通过质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)对其结构进行鉴定,以ELISA法检测其次生代谢产物对VEGFR2-CD的拮抗活性。结果分离得到两个环二肽类次生代谢产物:2832B和2832C;化合物2832B的化学结构与环(脯氨酸-酪氨酸)一致,化合物2832C的化学结构与环(苯丙氨酸-甘氨酸)一致,均对VEGFR2-CD表现出一定的抑制活性。结论化合物2832B和2832C是具有VEGFR2-CD活性的环二肽类次生代谢产物,本研究首次报道它们具有VEGFR2-CD抑制活性。

关键词： VEGFR2-CD 链霉菌环二肽拮抗剂

ste3与ste4基因双敲除对依博素生物合成的影响

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中国生物工程杂志 2015年第11期35卷 23-28页

作者：白利平姜蓉郭连宏张洋李元中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050

目的:以往研究已确定链霉菌胞外多糖依博素的生物合成基因簇(ste),生物信息学分析基因簇中ste3和ste4编码糖转运相关膜蛋白,现研究分析ste3和ste4与依博素生物合成的相关性。方法:通过基因同源重组双交换获得ste3和ste4双基因缺失突变株... 详细信息

目的:以往研究已确定链霉菌胞外多糖依博素的生物合成基因簇(ste),生物信息学分析基因簇中ste3和ste4编码糖转运相关膜蛋白,现研究分析ste3和ste4与依博素生物合成的相关性。方法:通过基因同源重组双交换获得ste3和ste4双基因缺失突变株,经Southern杂交验证后,对该菌株进行了基因互补研究。分离提取各菌株发酵液的胞外多糖,并计算产量。结果:双基因缺失株产生的胞外多糖依博素与野生株相比,产量从319mg/L降低至153mg/L,平均产量降低52%以上;基因互补后,依博素平均产量上升到299mg/L,基本恢复至野生株依博素产量水平。结论:本研究首次阐明了编码糖转运相关膜蛋白基因ste3和ste4在依博素的生物合成中起重要作用,为研究链霉菌139的初级代谢和次级代谢之间的相关性奠定了基础。

关键词：链霉菌基因双敲除 ste3 ste4 依博素

化合物1487B抑制肿瘤坏死因子-α生成机制研究

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中国药学杂志 2015年第20期50卷 1806-1810页

作者：马明张洋郭连宏白利平姜蓉李元中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

目的研究化合物1487B对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的作用,探讨其抗炎机制。方法利用荧光标记底物,检测在不同浓度化合物1487B作用下,THP-1细胞中肿瘤坏死因子-α转化酶(TACE)的活性;采用实时定量PCR法,分析肿瘤坏死因子-α的转录水平;利... 详细信息

目的研究化合物1487B对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的作用,探讨其抗炎机制。方法利用荧光标记底物,检测在不同浓度化合物1487B作用下,THP-1细胞中肿瘤坏死因子-α转化酶(TACE)的活性;采用实时定量PCR法,分析肿瘤坏死因子-α的转录水平;利用酶联免疫吸附实验及免疫印迹,测定肿瘤坏死因子-α的分泌表达水平。结果在THP-1细胞中,1487B对胞内TACE酶活性有一定的抑制作用,实时定量PCR检测1487B可降低肿瘤坏死因子-α转录,且呈明显的剂量依赖性;免疫印迹及酶联免疫吸附实验检测终浓度为50、100、200μmol·L-1的1487B作用THP-1细胞后,肿瘤坏死因子-α前体的表达减少63%(P<0.01)、72%(P<0.01)、67%(P<0.01),肿瘤坏死因子-α的分泌水平降低24%(P<0.05)、31%(P<0.01)、70%(P<0.001)。结论 1487B通过抑制THP-1细胞胞内TACE酶活性和肿瘤坏死因子-α转录,减少肿瘤坏死因子-α生成,本实验初步阐明了化合物1487B的抗炎机制,为其进一步应用奠定了基础。

关键词：新化合物 1487B 肿瘤坏死因子α 类风湿关节炎肿瘤坏死因子-α转化酶

大鼠α-酰胺化酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

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中国生物工程杂志 2007年第11期27卷 6-10页

作者：郭连宏齐小强姜蓉姚晨李元中国医学科学院/中国协和医科大学医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

α-酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,C末端α酰胺基团的存在对于许多生物活性肽的生物活性极为重要。通过PCR扩增获得了编码大鼠α-酰胺化酶的基因,以pET-30a为载体,重组质粒pET-A转化至*** BL21成功表... 详细信息

α-酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,C末端α酰胺基团的存在对于许多生物活性肽的生物活性极为重要。通过PCR扩增获得了编码大鼠α-酰胺化酶的基因,以pET-30a为载体,重组质粒pET-A转化至*** BL21成功表达了α-酰胺化酶。采用Ni2+-NTA亲和层析纯化重组蛋白,纯度为86%。该蛋白具有催化三肽底物((Dns-Tyr-Val-Gly)成为酰胺化二肽(Dns-Tyr-Val-NH2)的酶活性,这表明重组蛋白是α-酰胺化酶,有可能用于生物活性肽的酰胺化研究。

关键词：酰胺化酶克隆表达 His-tag亲合层析酰胺化生物活性肽

ste7与ste15双基因敲除对依博素生物合成的影响

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微生物学报 2009年第4期49卷 471-478页

作者：白利平姜蓉单俊杰郭连宏张洋李元中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050 军事医学科学院毒物药物研究所北京100850

【目的】研究ste7和ste15基因双敲除对依博素生物合成的影响。【方法】通过基因同源重组双交换,对ste15基因缺失突变株Streptomyces sp.139(ste15-)再进行ste7基因的敲除,经Southern杂交验证,获得了ste7和ste15双基因缺失变株Streptomyc... 详细信息

【目的】研究ste7和ste15基因双敲除对依博素生物合成的影响。【方法】通过基因同源重组双交换,对ste15基因缺失突变株Streptomyces sp.139(ste15-)再进行ste7基因的敲除,经Southern杂交验证,获得了ste7和ste15双基因缺失变株Streptomyces sp.139(ste7-ste15-)。对该突变株进行了基因互补。气相色谱分析ste7和ste15双基因缺失突变株及互补株产生的胞外多糖单糖组分,排阻色谱测定衍生物的重均分子量,ELISA法测定衍生物的IL-1R拮抗活性,并与依博素进行比较分析。【结果】获得ste7和ste15双基因缺失株Streptomyces sp.139(ste7-ste15-)及互补株。双基因缺失株产生的胞外多糖与依博素相比,葡萄糖与岩藻糖含量明显降低,分子量变小,生物活性明显下降。基因互补株产生的胞外多糖中葡萄糖与岩藻糖含量恢复。【结论】ste7和ste15基因编码产物参与了依博素生物合成中单糖重复单元序列的形成过程,在依博素的生物合成中起重要作用;变株产生的依博素新衍生物体内外活性有待进一步研究。

关键词： ste7基因 ste15基因基因双敲除链霉菌139 依博素新衍生物

链霉菌2754发酵产物的分离提取及结构鉴定

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中国抗生素杂志 2011年第6期36卷 412-415页

作者：刘祺蒋忠科郭连宏张洋吴剑波姜蓉中国医学科学院&北京协和医学院医药生物技术所北京100050

目的从链霉菌2754中提取分离和纯化小分子VEGF受体抑制剂,并进行结构鉴定。方法以酪氨酸酶活性测定方法(ELISA法)为活性跟踪方法,利用大孔吸附树脂反相HPLC等方法进行分离纯化。利用光谱分析,进行结构解析。结果分离纯化到两个七尾霉素... 详细信息

目的从链霉菌2754中提取分离和纯化小分子VEGF受体抑制剂,并进行结构鉴定。方法以酪氨酸酶活性测定方法(ELISA法)为活性跟踪方法,利用大孔吸附树脂反相HPLC等方法进行分离纯化。利用光谱分析,进行结构解析。结果分离纯化到两个七尾霉素类化合物nanaomycinαA和nanaomycinαA并具有相关活性。结论 NanaomycinαA和nanaomycinαA为已知化合物,首次报道该化合物具VEGFR拮抗活性。

关键词： VEGFR C2754 分离纯化结构鉴定